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1、体外诊断试剂的临床研究体外诊断试剂的种类化学或生化检测试剂 免疫学检测试剂抗原检测抗体检测 核酸检测试剂核酸杂交技术核酸扩增技术 其他试剂核酸扩增技术目的片段的扩增聚合酶链反应（PCR）以转录为基础的扩增技术（TAS）链取代的扩增技术（SDA） 探针的扩增连接扩增反应（LAR）以FEN-1 DNA聚合酶为基础的扩增循环探针 信号扩增免疫检测的原理直接法间接法免疫反应中按标记物分类同位素标记的放射免疫法 酶标记的酶联免疫法 生物素标记 化学发光物质标记的化学发光法 荧光素标记 时间分辨法 其他标记物临床研究的意义以及目的临床前样品虽有代表性，但数量毕竟有 限并不能完全代表临床情况 通过临床试验对
2、临床前制定的各项指标 进行修正 可以发现或预测在实际应用中遇到的问 题，在说明书中提醒用户注意临床研究的基本要求伦理考虑一般样品特殊样品 对研究对象保密 临床前研究结果对临床研究单位以及人员的要求从事相应的工作 具有相应的技术人员 有相应的仪器设备如果试剂对仪器无特殊要求，则应选择不同 品牌或不同型号 有不同专业人员参加 至少两家省级单位 对实施实验单位的能力进行评价指综合能力包括检测能力、仪器设备和人员 等,主要检测盲样，符合要求这方能参与对照方法或试剂的要求新诊断试剂疾病症状以及临床诊断相关试剂研究对象的追踪随访疾病的判断标准 已有同类产品的试剂可选择同类试剂; 若评价试剂所用的原料为 基
3、因工程产品，应用非基因工程 原料制备的 试剂进行评价；对结果不一致样品的处理临床样品的选择人群: 根据试剂的适应症选择不同的人群 样品: 应为自然人群，尚未用同类试剂进行筛 查过 选择不同地区: 代表被测物的不同流行率，代 表被测物的不同基因型或血清型 疾病的时期: 样品的数量:检测方法盲法平行检测结果不一致样品的进一步分析诊断试剂的临床评价指标 灵敏度 （Sensitivity）：在阳性样品中检出阳性 样品的百分比 特异性（Specificity）：在阴性样品中检出阴性 样品的百分比 样品分布 (eg. STDEV; )Suitability of cut-off 阴性预期值 (NPV)：若
4、样品没有反应，则不含检测 物的可能性 阳性预期值 (PPV)：若样品有反应，则含检测物体 的可能性 重复性（Reproducibility） 准确性（Accuracy) 精确性 (Precision）灵敏度定义：试剂的检测限度方法：检测一定数量的阴性样品，计算均值和标准差均值和标准差，临界值等于均值加上2个标准差意义：在临界值以上的样品有95%为真阳性 临界值的评估：检测一系列正常人群、非正常人群 和特殊人群对临界值进行核对表示方法：以量值表示（如ng，单位，CFU/ml， PFU/ml，拷贝数等）；以稀释度表示 影响灵敏度的因素 特殊疾病有一些特殊的病人，其代谢异常可能影响标志物 的检测 干
5、扰物质或抑制物质可以来自与病人（药物）；也可来自于样品的处 理过程（反复冻融，溶血等）；或样品本身存在抑制 物等 样品基因型和血清型的影响有些被测物存在多种基因型或血清型，若原材料 没有广谱性，则可影响灵敏度 试剂的灰区：对特殊的试剂要制定灰区，如FDA要求HCV抗体试剂 临界值以上均为灰区，对灰区样品要加倍重试核酸检测抑制物的作用原理核酸扩增需要酶的参与 酶发挥作用需要辅助因子以及特殊的条 件 辅助因子与酶的特殊部位物理结合后发 生反应 任何结合辅助因子、改变环境或阻止酶 与辅助因子特异结合的物质均抑制反应核酸扩增常见的抑制物血红素及其代谢物影响DNA聚合酶的反应，不 同来源的DNA聚合酶受
6、影响程度不同 痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影响DNA聚合酶 的反应 脑脊液和尿中可能含有抑制物，但具体物质不 明确 粪便中的胆汁盐是PCR反应的强抑制剂 肝素可与DNA聚合酶结合，对不同的酶抑制程 度不同 核酸提取试剂中的某些物质具有抑制作用： EDTA，SDS，盐酸胍等内标的种类未修饰性的内标异源性内标修饰性的内标特异性定义：主要指假阳性的检出情况评价方法：主要是通过检测部分样品， 或特殊样品尤其是性质相近的标志物（ 如不同基因型或血清型样品），分析出 现假阳性的情况；而且分析时要注意在 不同量时的特异性造成非特异性的因素原料：主要纯度不够，原料本身存在非特异反应物质 反应模式：如孵育时间缩短
7、非特异反应可提高3-4倍，非常短时可高达10倍 样品中的干扰物质：病人本身：如自身免疫性疾病（高免疫球蛋白血症 等），黄疸类、溶血类和高脂类病人病人使用特殊药物样品处理过程：如不同抗凝剂，不同试管，某些 化学或去污剂以及样品反复冻融等因素核酸检测中造成非特异性的因素交叉反应：主要是引物序列与被测物中序列 存在一定程度的同源性 样品之间的污染：气溶胶中含有目的微 生物，对照的污染等 扩增产物的污染：扩增产物聚集在器皿 、台面、设备以及通风设施上等造成污 染污染的处理酶的灭活（UNG） 主要用于灭活产物 光化学处理 用可溶性psoralen的衍生物处理 ，在用长紫外照射 即可灭活产物、也可减少样品
8、 的污染 化学处理方法 用于表面的处理 10%次氯酸钠 紫外照射 物理的: 专用移液器、一次性试管架、紫外灯、 PCR工作罩、滤芯吸嘴。样品典型的正态分布NegativeNegative populationpopulationPositivePositive populationpopulationFrequency of observationsFrequency of observations0 01001001 11010 Percentage of maximum signal (log)Percentage of maximum signal (log)Cut-offCut-off
9、特异性与值关系的分析企业假阳性特异性（%）值金豪 万泰 GBI 耀华 科华 丽珠 华美 新创 普生 绿科 中山 理利 Murex 梅里埃 3 2 5 1 0 3 2 7 15 1 8 22 11 4 99.70 99.80 99.49 99.90 100 99.70 99.80 99.29 98.48 99.90 99.19 97.77 98.88 99.59 -3.985 -3.688 -3.423 -3.364 -3.687 -2.741 -4.337 -3.636 -2.261 -3.060 -2.778 -1.774 -3.551 -4.311 样品库有985份样品。特异性与其“”值相
10、关性系数为0.691,具有显著的统 计学意义(P=0.004） d - d+值的计算以及意义delta = d / SDcut-offloglog1010 OD/COOD/COXX0 0FrequencyOD/CO data OD/CO data must be must be transformed to transformed to loglog1010 values values before the before the analysisanalysis数值的计算样品的实际状态+ - + 检测结果-A BC DA+BC+DA+C B+D灵敏度= A/（A+C);特异性=D/（B+D）
11、阳性预期值:1)简单的计算方法即：PPV=A/（A+B） 可以给出一个大约的数值;2)精确的计算方法即：PPV= 流行率敏感性/流行率敏感性+（1-流行率）（1-特异性) 阴性预期值:1)简单的计算方法即：NPV=D/（C+D） 可以给出一个大约的数值2)精确的计算方法即：NPV=(1- 流行率）特异性/（1-流行率）特异性 + 流行率（1-敏感性) 精确性(Precision)作用：评价试剂的随机误差 通过重复检测某一或某些特定样品并分 析其一致性，通常以变异系数或相对标 准误来表示 样品的要求：最好应含有高、中、低三 类 每一类样品至少检测4次，实际上检测10 次或10次以上准确性（acc
12、uracy)主要评价试剂的系统误差，反映样品的 检测值和真实值的一致性 表示方法：偏差（%）=（检测值-真实值）X100/真实值 评价方法：1.在某一样品中加上已知量的检测物重复检测 ，计算检测值与预期值的偏差2.检测已知量的参考品，计算检测量与标化量 的偏差定量范围定义：能够给出准确量值的范围建立的方法：主要对系列稀释样品的反复检测制定的定量曲线：线性或非线性要求：对定量范围的上限和下限样品进行检测时，其精确性仍能符合要求重复性（Reproducibility）不同实验次数之间（Run-run）不同实验室之间（Site-site）不同实验人员之间（Operator-operator）不同时间之间（Day-day）特殊情况下的重复性定量试剂的特殊要求样品所含被测物的量应该分散应含有在最高和最低检测限的样品与参比试剂的检测结果计算相关性，而 且要统计两种检测结果的量值有无统计 学差异
