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1、微生物学浙江工业大学生物技术系裘娟萍 钟卫鸿 邱乐泉 汪琨第四节 免疫学方法及其 应用传统的免疫学方法仅局限于用体液免疫产生的抗体与各种抗原在体外进行反应，所用抗体都取自血清，因此称作血清学反应（serologicalreaction）。体液免疫细胞免疫现代免疫学方法免疫诊断学（immunodiagnostics）免疫学检测，等分支技术学科一、血清学反应1. 定义在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应。已知抗体已知抗原未知抗体未知抗原检测检测2. 血清学反应的特点（1）特异性抗原决定簇和抗体分子V区间的各种分子引力是它们间特异性的物质基础。A抗原结合 A抗体B抗原B抗体结合A抗原刺激机体A抗体
2、B抗原B抗体（2）可逆性抗原抗体间的结合仅是一种物理结合，故在一定条件下是可逆的。抗原与抗体结合后，其原有的毒性等性状均为改变。抗原物质表面的抗原决定簇数目一般较多，多价；抗体一般仅以Ig单体形式存在，双价。（3）定比性抗原与抗体结合，只有两者分子比例适当才能形成肉眼可见的反应。抗原与抗体的反应一般有两个明显的阶段。第一阶阶段抗原与抗体结合形成复合物 （一般仅仅数秒）时间短不可见第二阶阶段复合物与环境因素作用 （从数分钟钟至数小时时或数天 ）时间长可见（4）阶段性最佳条件一般为：pH=68，3745，适当振荡，以及用生理盐水作电解质等。（5）条件依赖性二、抗原、抗体间的主要反应（一）凝集反应（
3、agglutination）颗粒性抗原（完整的细菌细胞或红细胞等）与相应的抗体在合适的条件下反应并出现肉眼可见的凝集团的现象，称为凝集反应（agglutination，agg，aggl）或直接凝集反应（direct agglutination）。在作凝集反应时，由于抗原体积巨大，抗原结合价相对较少，所以为使抗原和抗体间有一合适比例，一般都应稀释抗体（即抗血清）。抗原凝集原（agglutinogen）抗体凝集素（agglutinin）（1）直接法玻片法试管法例如，诊断伤寒或副伤寒症的试管定量试验肥达氏试验（Widals test），菌种鉴定或定型中的玻片凝集试验等。（2）间接法典型的间接凝集试验
4、（indirect agglutination test）又称被动凝集反应（passive agglutination）。其基本原理是将可溶性抗原吸附到适当载体上，使其成为人工的“颗粒性抗原”，从而也会产生凝集反应而可用肉眼检出。可用作载体的材料有人和动物的红细胞，活性碳或白陶土颗粒，以及聚苯乙烯乳胶微球等。可测定的对象:抗细菌抗体、病毒抗体、Leptospira (钩端螺旋体属)抗体以及Treponema pallidum（梅毒螺旋体）抗体等。把抗体吸附于红细胞等颗粒上，以检出相应的抗原，称为反相间接凝集试验。例如，用于血液中HBsAg（乙型肝炎表面抗原）、甲胎蛋白和钩端螺旋体的诊断等。血型
5、的鉴定血型的鉴定A标标血清（A-Ab） B标标血清（B-Ab）被测测者血细细胞被测测者血细细胞被测测者血型O型A型B型AB型血型A抗原B抗原O型无无A型有无B型无有AB型有有在体内凝集反应能增强吞噬作用；在体外凝集反应可用于血型检查和菌种鉴定；（二）沉淀反应（precipitation）可溶性抗原与其相应的抗体在合适条件下反应，并出现肉眼可见的沉淀物的现象，称为沉淀反应（precipitation，pptn）。沉淀原（precipitonogen）沉淀素（precipitin）抗原抗体常见的可溶性抗原蛋白质质多糖类类脂溶液血清细细菌抽提液组织组织 浸出液三、免疫标记技术免疫标记技术（immun
6、olabelling technique）免疫定位分析（immunolocalization）免疫亲和层析（immunoaffinity chromatography）免疫生物传感器技术（immunobiosensor technique）免疫标记技术（immunolabelling technique）是指将抗原或抗体用小分子的标记剂如荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质等加以标记，借以提高其灵敏度和便于检出的一类新技术。优 点：特异性强，灵敏度高，应用范围广，反应速度快，容易观察，能定性、定量甚至定位。免疫酶技术又称酶免疫测定法（enzyme immunoassay，EIA）。一种利用酶
7、作标记的抗体或抗抗体以进行抗原、抗体反应的高灵敏度的免疫标记技术。（二）免疫酶技术（immunoenzymatic technique ）此法由Engvall等于1971年提出。其原理是用酶来标记抗体或抗抗体，带上酶标记后的抗体仍然能与抗原反应，酶结合抗体后仍具其催化活性。由于酶的催化作用，可使原来无色的底物通过水解、氧化或还原反应而显示颜色。免疫酶技术的优点：由于是产色反应，故可用普通光学显微镜观察结果；标本经酶标记的抗体染色后，还可用其他染料复染，以显示细胞的形态构造；标本可长久保存，随时查看；特异性强；灵敏度高。标记酶应具备：纯度高、特异性强、稳定性和溶解度好；测定方法应简单、敏感、快速
8、；与底物作用后会呈现颜色；与抗体交联后仍保持酶的活性。 最常用的是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），它是一种糖蛋白，主要成分是酶蛋白和铁卟啉，相对分子量为4.0104，底物是二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）。DAB经水解后可产生棕褐色沉淀物，可用目测或用比色法测定。 此外，还有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）、脲酶（urease）和-D-半乳糖苷酶（ -D-galactosidase）等。酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA），又称酶标法，已被广泛
9、用于各种抗原和抗体的检测中。双抗体夹心法（double antibody sandwich method，sandwich ELISA）间接免疫吸附测定法（indirect immunosorbant assay， indirect ELISA ）常用双抗体法是一种测定待检标本中是否含抗原的方法，其主要步骤为：将含已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔内，洗涤一次；加入待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，将多余的抗原洗去；加入对待测抗原有特异性的酶联抗体，使形成“夹心”；加入该酶的底物，然后产生可见的有色酶解产物（黑圆点），这就说明在孔壁上有与已知抗体特异的抗原存在。可用于组织切片、细胞培养
10、标本等组织或细胞抗原的定性、定位，也可用于可溶性抗原或抗体的测定。四、生物制品及其应用在人工免疫中，可用于预防、治疗和诊断用的来自生物的各种制剂，都称生物制品（biologics，biologic products）。生 物 制 品特异性的抗原（疫苗、菌苗、类毒素）抗体（治疗用的血清、诊断用的血清、免疫球蛋白、单克隆抗体等）细胞免疫制剂非特异性的免疫调节剂（immunoregulative preparation）人工自动免疫类生物制品人工被动免疫类生物制品（一）疫苗（vaccine）菌苗疫苗用于预防传染病的抗原制剂称为疫苗。用病毒、立克次氏体或螺旋体等微生物制成的生物制品用细菌制成的生物制品
11、活疫苗（live vaccine）死疫苗（dead vaccine）如，卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG）、鼠疫疫苗、脊髓灰质炎疫苗和甲型肝炎疫苗等。如，流行性乙型脑炎、百日咳、伤寒、霍乱、狂犬病、流行性感冒等死疫苗。用人工的方法是病原体减毒或从自然界筛选某病原体的无毒株或微毒株所制成的活微生物制剂，又称减毒活疫苗（attenuated vaccine）。活疫苗（live vaccine）用理、化因子杀死病原体，但仍保留原有的免疫原性的疫苗，称死疫苗。死疫苗（dead vaccine）（二）类毒素（toxoid）细菌的外毒素经甲醛脱毒（0.30.4）后仍保留原有的
12、免疫原性的预防用生物制品。目前应用的精制吸附类毒素是将类毒素吸附在明矾或磷酸铝等佐剂上，以延缓它在体内的吸收、延长作用时间和增强免疫效果。常用的类毒素有破伤风类毒素和白喉类毒素等。（三）自身疫苗（ autovaccine，autogenous vaccine ）又称自体疫苗，指用从病人自身病灶中分离出来的病原体所制成的死疫苗。例如由葡萄球菌引起的反复发作的慢性化脓性感染或是由大肠杆菌引起的尿路感染等，当用抗生素治疗无效时，就可设法从其自身病灶中分离病原菌，待制成死疫苗并作多次皮下注射后，有可能治愈该病。（四）单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）1. 定义指有一纯系B淋
13、巴细胞克隆经分化、增殖后的浆细胞所产生的单一成分、单一特异性的免疫球蛋白分子。是创建于是创建于19751975年的利用淋巴细胞杂交瘤产生单克年的利用淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体的技术。隆抗体的技术。2. 淋巴细胞杂交瘤技术（hybridoma technique）淋巴细胞杂交瘤（lymphocyte lymphocyte hybridomahybridoma）又称又称杂交瘤（hybridomahybridoma），），是指将能够产生抗体是指将能够产生抗体的的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖力的和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞（myelomamyeloma cell cell）融合在一起，形成融合在一起，形成杂交瘤细胞杂交瘤细胞。这种这种单一类型的的只针对某一特定抗原决定簇的的抗体分子，就是单克隆抗体。，就是单克隆抗体。体外快速生长体外快速生长持续分泌成分单一的特异性抗体持续分泌成分单一的特异性抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞3. 单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用 单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等 单克隆抗体靶向制剂，治疗癌症等疾病 杂交人鼠单克隆抗体下节课再见了
