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1、微生物应用技术1 1杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院主要内容基础知识技术单元2 2杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院基础知识 目 录绪论微生物资源及其开发利用微生物发酵方式与设备3 3杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院绪论l微生物应用技术的研究对象和内 容 生物资源转化技术研究 资源和环境微生物技术研究 发酵新产品、新工艺的研究 分子生物技术研究 生化工程技术研究4 4杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院微生物应用技术发展简史我国人民在距今约8 000年至4 500年间，已发明了制曲 酿酒工艺 在2 500年前的春秋战国时期，已知制酱和醋 在900年前，利用自养细菌生命活动的胆水浸铜法(类似于今日的细
2、菌沥滤)已正式用于生产铜 2 500年前就知道利用麦曲治疗腹病 在宋代还创造过“以毒攻毒”的免疫方法，发明用种人痘来预防天花 2 000年前，我国人民就用“客土法”种豆 当代微生物技术的应用 5 5杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院l当代微生物技术的应用 微生物技术在医药卫生上的应用 微生物技术在工农业生产中的应用 微生物技术在粮食、能源、环境和农业可 持续发展上的应用 微生物技术在采油冶金上的应用6 6杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院l微生物资源概况n 微生物资源的特性n微生物的特点分布、数量、各类的多样性生长繁殖速率快、易于培养易变异代谢类型多样性生活多样性7 7杨凌职业技术学院杨凌职业技术
3、学院n微生物的形态细菌(形态、大小、结构、繁殖方式、菌落特征)放线菌(形态、结构、繁殖方式、菌落特征)酵母菌(形态、结构、繁殖方式、菌落特征)霉菌(形态、结构、繁殖方式、菌落特征)食用菌8 8杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n 微生物的营养特性 微生物的营养类型 微生物的营养条件n 微生物的生活环境 水 pH 温度 氧气 光9 9杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n 微生物资源的分布n土壤中的微生物分布广、种类多 土壤微生物分布的不均匀性(气候因素、区域等)n水体中的微生物水生微生物、其它外源n空气中的微生物G+球菌、芽孢菌的芽孢、放线菌和真菌的孢子1010杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n 微
4、生物资源的开发利用概况已发现的微生物占微生物总数的10%。n细菌资源的利用皮革加工、纺织品脱胶、发酵食品生产、菌肥、生物农药、冶金、畜牧业、污水处理。n放线菌资源的利用2000多种抗生素、石油脱蜡、烃类发酵等。1111杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n真菌资源的利用全世界大约有真菌2.53.0105种，中国至少有 1.0105种(陈文新，1989)。酵母菌：酒精发酵、SCP、提取核酸、GSH、CoA等。霉菌：制酒、酿造、酶制剂、核酸、生长刺激素、抗生素、生物杀虫剂、饲料等。食用菌：菌根菌：1212杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院从目前来看，微生物的应用潜力很大，在农业、工业、医药上都有很大的用
5、途，其在农业上的发展前景主要 有以下几个方面：l微生物肥料：化学肥料在土壤中有残留可引起环境污染 ，而微生物肥料既可以培肥土壤、促进作物生长，而且还可 以改变土壤团粒结构，无残留，可保护环境。 l微生物农药：微生物农药与化学农药相比，其优点是： 制造简便，有利于土法生产；选择性强，对病虫害起作用， 对人畜及作物无害，一般不伤害有益昆虫和动物，而化学农 药在杀病虫害的同时也杀死益虫；在适宜条件下，杀虫微生物能自然感染，在较长时间内发挥杀虫作用。 1313杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院l微生物能源：主要利用微生物进行沼气发酵，可节约大量燃料，在农村，将沼气发酵与沤肥结合起来进行综合利用，既节约燃
6、料又能保肥提高肥效，还能改善环境卫生，防止疾病传播。 l微生物饲料 ：l食用菌：是一种高蛋白、低脂肪、低热量的食品，其营养价值和保健价值已为人们所认识，其开发潜力不可估量。 1414杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院l微生物资源开发的原则与步骤n微生物资源开发的原则开发意图的明确性原则 开发过程的创新性原则 模型设计的关键性原则 一菌多用的原则 使用混合菌的原则 微生物资源及其开发利用1515杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n 微生物资源开发的步骤微生物资源的开发主要是利用微生物菌体本身，或其代谢产物，或其某种特性或活性或其总和，尽早找到目的菌，一般的开发程序大体包括下图所示的步骤。1616杨凌
7、职业技术学院杨凌职业技术学院总设计(开发目的、策略、工作基础、市场、投资、风险等)试样的采集(环境因素、天然及人工基质、微生物代谢类型等)产生菌的分离(富集、预处理、抑制剂、培养基设计、培养条件等)初筛(选)(产生菌的培养、发酵、模型设计、目的产物或性状的测定等)复筛(选)目的产物或性状的复核、产生菌工艺性状的考察)高产(高活性)产生菌(野生菌)小型试验(产生菌的最佳培养条件、生物学特性研究、菌种鉴定、工艺路线)目的产物制备目的性状、活性的测定化学结构鉴定毒性（体外试验）大量制备小型应用试验体内试验、药理研究临床试验中间试验（菌种选育、最佳工艺、技术经济评价）产业化工业性试验（验证、修改、优化
8、技术经济指标）1717杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院l资源微生物的分离n 样品采集 土壤样品采集 湖泥样品采集 温泉水样品采集 1818杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n样品处理样品处理的目的是为了增加目的菌的数量，同时尽可能减少 其它菌的影响，可以从以下几方面考虑：目的菌加料培养可向样品中加入目的菌所需的部分养分，然后培养一段时 间，从而增加目的菌的数量。抑制培养在样品中加入目的菌所需的成分及微量成分(氨基酸、维 生素等)，再加入其它菌的抑制剂，培养适当时间。高温培养土壤样品风干后120干热处理1小时，可降低真菌、细菌的数量，而增加孢子放线菌和高温细菌的数量，如果为了分离高温菌 ，也可以将
9、样品加适当成分，在特定高温(如60或70)下振荡培养若干时间，可减少非耐热菌的干扰。1919杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n 不同微生物的分离方法 微生物分离是一项重要的技术，不 同微生物的分离方法各不相同，一般来说， 真菌、细菌的分离比放线菌容易，但要分离 全新稀有的真菌、细菌也较困难，资源微生 物的分离大体可以分为两种情况，一种是分 离特定目的的资源菌；另一种是分离特定环 境的全部微生物。2020杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院细菌分离方法细菌的生长较快，通常情况下不考 虑真菌和放线菌的污染，除了掌握前述原则 外，分离资源细菌应注意以下几点：u1培养基成分以牛肉膏和蛋白胨为主u2pH控制
10、在中性左右u3如需抑制其它微生物的生长，一般加 50100单位的放线菌酮或制霉菌素。2121杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院真菌分离方法分离真菌一般并不困难，分离资源真菌 应注意的问题是：u1以Martin琼脂和Czapek琼脂为基本培养基。u2pH一般在5左右。如果为了使培养基的pH在 4或以下应在中性pH消毒，倒平板时调pH至4以下。u3真菌菌落扩展很快，务必及时挑菌。2222杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院放线菌分离放线菌分离方法是尽可能让试样中的全 部放线菌都长出来，而其它细菌、真菌又尽可能不 长，因此，应根据不同类群放线菌的生理特性和营 养要求，配制不同营养成分，不同pH，添加不同抑
11、 制剂及其它特殊物质(维生素、激素等)的多种培养基。采用不同的培养条件，包括不同的培养温度、 培养时间等，对试样进行处理和培养。 2323杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院u1样品处理样品处理的目的为了减少真菌、细菌的数量，增 加放线菌(尤其是目的放线菌)的数量，目前采用的方法有： 土样自然风干5至30天，可大大减少细菌的数量、增加放 线菌的出菌率；风干土样在120干热处理1小时(潮湿的 土样不能如此处理)，可减少真菌、细菌的数量，增加孢子放 线菌的出现率；综合处理，Hayakawa等设计的预处理方 法(表11)建议用0.05的SDS(5mmolL磷酸缓冲液配制) 加1的腐殖酸或6%的酵母膏，4
12、0震荡20分钟。表中可看到处理后细菌数量明显减少。2424杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院u2试剂选择在放线菌分离过程中，为了增加目 的放线菌的数量，减少真菌、细菌及不需要 的放线菌的数量，通常在分离培养基中加入 目的菌能忍耐而其它菌敏感的物质，以达到 选择分离目的菌的目的。2525杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院稀有菌的分离方法为了寻找某个特殊类群的菌株，要求分离方法有 很高的选择性，不仅要抑制细菌、真菌的生长，而且还要抑 制常见的链霉菌、甚至其它稀有放线菌的生长。u1高温菌的分离土样风干，磨细，120(或80100)干热处理 1小时，水样可在6080处理l小时，用燕麦片琼脂、酵母膏 麦芽膏
13、琼脂及其它合成琼脂，琼脂用量为3，土样一般稀 释10倍，100倍，发热材料稀释1000倍左右，涂于平板52 以上培养 37天后挑菌，为了抑制细菌，可加5.0105重 铬酸钾或1单位ml青霉素。2626杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院u2低温菌的分离用采样地点的土壤作成的土壤浸汁 琼脂、甘油天门冬酰胺琼脂，均加5.0105 重铬酸钾或100ugm1的放线酮、100 ug m1制霉素和5个单位ml的青霉素，土样稀 释10倍， 100倍，涂于平板，5，10， 15培养4周以上挑菌。2727杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院l资源微生物的保存n 开发过程中菌种的保存 待选菌株 试管斜面保存于4中 入选菌
14、株 1尽量减少转代次数 2在维持生产性能的前提下，调换 斜面培养基成分，最好不要永远使用一种培 养 基。3.暂时复壮措施 2828杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院 专利菌种和优良菌种这两类菌种本身并无本质差别，它们的数量少，一般都已定名，这些菌种都无例外需要长期保存。2929杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院n 微生物菌种的长期保存 砂土管保存 甘油保存 麦麸保存 冻干保存 液氮保存 3030杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院微生物发酵方式与设备l发酵的方式n 微生物发酵技术的发展发酵的定义：凡是利用微生物在有 氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌 体或其代谢产物的过程统称发酵。 3131杨凌职
15、业技术学院杨凌职业技术学院发酵工程是利用微生物特定的性 状和功能，通过现代工程技术生产有用物质 或直接应运于工业化生产的技术体系，是将 传统发酵与现代的基因重组，细胞触合，分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发 酵技术。也可说是渗透有工程学的微生物学 ，是发酵技术工程化的发展。由于主要是利 用微生物发酵过程来生产产品，因此也可称 为微生物工程。3232杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院发酵工程基本上可以分为发酵和提 取两大部分。发酵部分是微生物反应过程， 提取部分也称为后处理或下游加工过程。虽 然发酵工程的生产是以发酵为主 ，发酵的好坏是整个生产的关键，但后处理在发酵生产 中也占很重要的地位。
16、完整的发酵工程应该是指包括从投 入原料到获得最终产品的整个过程。 3333杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院发酵技术的发展经历了传统发酵时期 ，近代发酵工程时期和现代发酵工程时期。 （一）传统发酵时期（1680年以前）当时人们并不知道微生物与发酵的 关系，对发酵的原因根本不清楚，只是依靠 口传心授，一代代的传授这种发酵的工艺。 这一时期被称为自然发酵时期，也叫传统发 酵时期。 3434杨凌职业技术学院杨凌职业技术学院（二）近代发酵工程时期近代微生物发酵工程的建立与显微镜的诞生密不可分。 （三）现代发酵工程时期。 生物技术又称生物工艺学，有时也称生物工程， 是指“应用自然科学及工程学的原理，依靠生物催化剂的作用，将物料进行加工以提供产品或为社会服务”的技术。生物技术的依据和出发点是生物有机体本身的
