《分子遗传学》第六章

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1、 外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章第六章 基因的重组与转移基因的重组与转移 一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与 3-OH连到一起。第一节 DNA片段的体外连接1. 两段DNA的连接依靠粘性末端2. DNA片断与载体的连接依靠粘性末端ligase nick二、齐平末端（blunt end）的连接5端与3端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。1. 直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -O

2、H-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。（1）同聚加尾 法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。 原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 加尾碱基互补缺点：优点：能把任何 片段连接 起来不能把 插入片 段再切 下来。非酶切位点用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接 linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEco

3、RI linker： linker的作用缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:优点：（3 3）DNA接头 (adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 adapter的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP

4、-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起 ，影响与DNA片段的连接。 优点：连上后就能用。 缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头 ，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。） 防止自我连接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-PP-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGG

5、CC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5GATCCCGG- HO-GGCCCCGG-OH -GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口HO-OHCIP处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。三、PCR产物的连接1. 在引物的5端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3端1520

6、bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。（5端多余的35bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC 互补序列模板EcoRI位点5-3 GCAGAATTC 互补序列5-3 3 模板 GCAGAATTC 互补序列 PCR产物5-3 3 复性延伸模板模板 3 3 GCTAGCCGG 互补序列模板BamH I 位点-5 3- 5 复性延伸模板模板 3 3 GCTAGCCGG 互补序列-5 3-模板5 GCTAGCCGG PCR产物 互补序列-5 3-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC PCR产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物-

7、5 3- CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC PCR产物5-3 GCTAG PCR产物-5 3-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！2. 与T载体直接连接（1）PCR产物两个3端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3端再加上一个多余的核苷酸（ 优先加A）。（2）T载体的两个3端人为地各加一个T利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物TATA四、DNA体外连接应注意的事项1. 插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地

8、连接。尽量避免平端连接。决不能进行非互补粘性末端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。2. DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以 固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时 候，更要注意。ATGGAATTC 载体ATGCGGAATTCT 插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组但移码突变！4

9、. 防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10 倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5磷酸被除去，不能自我连 接。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体 插入片断1. 载体自身环化连接（能存活）2. 载体之间互相连接（能存活）3. 插入片段互相连接（不能存活）4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）1. 目的增加受体菌 细胞膜的通 透性。第二节 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。2. 菌种用CaCl2处

10、理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3. 制备原理4. 制备过程培养大 肠杆菌OD600至 0.3-0.4On ice 5- 10 min4离心 收集菌用冰冷的 100mMCaCl2 重悬4离心 收集菌4离心 收集菌分装、-70 冻存用冰冷的 100mMCaCl2 重悬On ice 30 min用冰冷的 100mMCaCl2 重悬二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1. 外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过

11、程。每 g DNA 转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率简单，但转化效率不高（106-108 / gDNA）。（1）热休克法（heat shock）转化效率高（高于109 / gDNA）。（2 2）电转化法）电转化法10ng载 体DNA100L感 受态菌 On ice混 合，静置 10分钟42C 1.5分钟加入1mL LB培养基37摇1小时10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板吸附DNA 摄入DNA（1）热休克法LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6冰浴15分钟， 2C离心集菌冰冷的水 重悬菌体2C离心 集菌冰冷的水 重悬菌体2C离心 收集菌体少量冰冷 的水重悬分装成

12、50-300L 电转仪调为 2.5kV, 25F 脉冲控制器 200-400 0.5g质粒 DNA On ice 混合加入 1mLSOC 培养液37C中速震 荡60分钟10-100L转化液涂 含抗菌素的平板转化（2 2）电转化法）电转化法4. 4. 平板培养平板培养 基培养细菌基培养细菌10-100L转 化液涂于含抗 菌素的平 板37过夜环形重组质粒 质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。环形质粒数（1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 必须在冰冷的条件下制备要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 储存感受态菌要在-70以下 CaCl2处理

13、 使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞 （competent cells) 把重组的噬菌体 DNA 或 Cosmid 质粒 DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6. 体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的 DNA 接受器位 点（receptor site)，使带有外源基因的 重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增 。cI 857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因 感染细菌后，在32下培养细菌时能够保 持溶源性。 但当温度升高到4445时，就会导致 cI基因编码的阻遏

14、蛋白失活，DNA复制 、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857 基因突变的 噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变 ，所以细菌还不裂解。cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋白 4445DNA转录、翻译合成外壳蛋白32噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。 （4） 互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白） 。噬菌体2(5) 体 外 包 装 过 程

15、 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受 体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。 （6） 转导 转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节 外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1. 菌株选择如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his31（1）利用原生质球进行转化 2. 酵母的转化方法酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、 PEG插入外源基因 的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允 许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 转化酵母0.1mol/L LiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40% PEG 4000（2）利用Li+盐进行转化叶盘消毒切取土壤农杆 菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1. 叶盘法（leaf disk)植物细胞原生质体纤维素酶 和果胶酶DNA混合入电 击缓冲液1-2kV, 3-25F 电击愈伤组织幼苗分化2. 电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2m钨弹头 吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（gene gun） 4.农杆菌（a