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1、第七章 外源化学物致突变作用公共卫生学院卫生毒理学系1第一节 致突变作用一、基本概念二、致突变的因素三、突变的类型四、致突变作用机制五、突变的后果第二节 致突变试验方法一、致突变试验的基本问题二、致突变试验的分类三、重要的致突变试验四、致突变试验方法的选择利用2第二节 致突变试验方法一、致突变试验的基本问题l 定义：确定化合物是否具有致突变作用的试验。l 目的：检测化合物是否具有致突变作用用以推测是否具有致癌、致畸等的可能性为化合物的可使用性研究和卫生标准制定提供依据l 基本原理：将化合物与生物测试系统接触，然后观察该生物 系统是否发生致突变性检测指标的改变，以判定其是否具有致 突变性。凡能使
2、生物测试系统发生突变的化合物，即可认为具 有致突变作用。3生物测试系统微生物 细菌、真菌、酵母菌等 昆虫 果蝇、蟾蜍等 哺乳动物细胞株 （ CHO、V79 、人类淋 巴细胞等） 整体哺乳动物（小鼠，大鼠等） 植物细胞 （紫露草，蚕豆根尖） 4一、致突变试验的基本问题l 致突变试验的遗传学终点：DNA原始损伤DNA碱基序列改变（基因突变）染色体完整性改变（染色体畸变）染色体组畸变（非整倍体）5 遗传学终点（genetic endpoint)： 指致突变试验的观察终点，因为不少致突 变试验的观察终点并不反映基因突变、染色 体畸变或染色体组畸变类型，而是反映致突 变过程中发生的其他事件。如微核是检测
3、断 裂剂和部分非整倍体致突变剂。 6DNA原始损伤 彗星试验 SCE（姐妹染色单体交换试验） UDS（程序外DNA修复试验） 枯草杆菌DNA修复试验 SOS显色试验 原噬菌体诱导试验 酿酒酵母有丝分裂重组试验7DNA碱基序列改变（基因突变） Ames试验 Tk基因座或hgprt座突变试验 转基因动物试验8染色体完整性改变（染色体畸变） 微核试验 染色体畸变分析9染色体组畸变（非整倍体） 染色体畸变分析 显性致死试验 微核试验10二、致突变试验的分类l 根据检出的突变类型分类l 根据生物测试系统分类l 根据试验时间长短分类l 根据试验进行的方式分类l 根据发生突变的细胞分类l 根据检测终点分类
4、11三、重要的致突变试验(一)Ames试验 (鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验)1. 原理： 是利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测物质致突变性的方法。常用的组氨 酸缺陷型沙门氏菌，均各含有控制组氨酸合成的基因，当培养 基中不含有组氨酸时它们不能生长。但在受到某些致突变物作 用时，菌体内DNA 特定部位发生基因突变而回复为野生型菌，此时，培养基中不含组氨酸该菌也能够生长。2. 常用菌株：目前推荐使用TA100 TA102 TA1535 TA97 TA98（测试碱基置换） （测试移码突变）12(一)Ames试验 3. 化合物的测试及结果评价： l 点试法：用作定性
5、试验，适用于短期大量筛选阳性阴性表层培养基指示菌S9培养48小时受试物10l13(一)Ames试验 3. 化合物的测试及结果评价： l 平板掺入法：用作定量测定培养48小时阳 性阴 性表层培养基指示菌S9受试物14(一)Ames试验 3. 化合物的测试及结果评价： l 阳性结果判定：平均每皿回变菌落数为对照(自发回变菌落数)的2倍及以上可重复性，用一个相应菌株重复 (阴性全套菌株重复)；有剂量反应关系。试验中注意设立阳性和阴性对照组。15(一)Ames试验 4. 试验的优缺点： l 检出率较高、重现性好、简便、快速、经济；l 使用S9，具有与体内相似的代谢特点；l 固体、液体、气体样品均可检测
6、；l 微生物遗传密码甚少；远不及哺乳动物；l 受试物需命中限定数目的靶基因，才能显示致突变活性。16(二)染色体畸变分析 1. 原理：将受试物与检测系统(动物或细胞)接触，然后直接观察生物体的细胞染色体发生的结构或数目的改变。 可在体细胞(骨髓细胞、外周血细胞)或生殖细胞(精原细 胞)进行。可为体外试验，也可为体内试验。2. 具体方法3. 结果分析 每个剂量组至少观察500个中期分裂相细胞细胞畸变率（）染色体畸变率（）17断片18染色体图像分析系统染色体被自动排序19(三)微核试验 1. 原理：细胞染色体在致突变物的作用下出现断裂，部分碎片在有丝分裂末期不参入细胞核，而存留在间期细胞质内，形
7、成一个或几个园形或杏形结构，并保留一段时间。因此，可以 通过微核的检测推断受试物的致突变性。由于形成的园形或杏形结构较正常核小（小于正常间期 核的1/31/5，红细胞直径的1/201/5），故称为微核。2. 方法3. 结果分析 每个剂量组至少观察5000个细胞细胞微核率（）20微核嗜多染细胞21(四)显性致死突变试验 1. 原理 显性致死是指在发育中的生殖细胞（精子）在致突变物的作用下发生了染色体损伤，从而使受精卵在发育过程中死亡。由于发生在子 1 代，故称为显性致死。因此，可以利用这一原理来检测化学物质的致突变性。该试验是间接观察生殖细胞染色体损伤的方法。22(四)显性致死突变试验 2. 方
8、法 选择雄性成年动物(小鼠或大鼠)并接触受试物(6天或3个月)与雌性动物(每周交换一批)同笼交配68周同笼第1719天处死雌鼠并取出子宫进行检查(受孕情况，活胎数，早期死亡和晚期死亡胚胎数)2324(四)显性致死突变试验 3. 结果分析 最主要的观察指标是早期胚胎死亡数，它可以反映化合物致突变作用的强弱。受孕率(%)(受孕鼠/交配雌鼠数)100总着床数活胎数早期胚胎死亡数晚期胚胎死亡数平均着床数总着床数/受孕雌鼠数早期胚胎死亡率(%)(早期胚胎死亡数/总着床数)100晚期胚胎死亡率(%)(晚期胚胎死亡数/总着床数)100 平均早期胚胎死亡数早期胚胎死亡数/受孕雌性动物数25(五)精子畸形试验
9、1. 原理：精子畸形是指精子形态和畸形精子数量的增多。精子畸形试验是利用精子形态检测法来检测化合物对生殖细胞的 致突变作用。2. 方法3. 结果分析 精子畸形主要表现在头部一般可分为：无钩，香蕉形，无定形，尾折叠，双尾等现也有分为：头部，颈部，中断和尾部畸形2627(六)单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)又称彗星实验(comet assay)，是近年发展起来的一种快速检测哺乳动物细胞DNA损伤的实验方法。1. 原理：在高pH值环境中，断裂的DNA分子由于带负电在电场中向阳极伸展，形似慧星尾。DNA受损越重，含
10、断裂片段越多，在彗星尾中出现的DNA就越多，表现为尾长和尾部荧光强度增加；而未受损伤的细胞DNA在电泳中仍停留在原位形成固形荧光团。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量测定DNA损伤程度。28(六)单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）2. 方法单细胞悬液制备制片细胞裂解解旋、电泳中和、染色3. 结果评价图像分析；目镜测微尺测定；评分法29(六)单细胞凝胶电泳试验（彗星试验） 细胞DNA不同损伤程度的彗星电泳图 根据“彗星”尾部 占头部的大小百分比将 细胞损伤分为：0 - 无损伤 95%30七、姐妹染色单体交换试验 在DNA合成期，所有染色体均进行复制， 复制后形成两条姐妹染色单体。
11、姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange,SCE)指染色体复制过程中同一条 染色体中的两条染色单体间发生遗传物质的 互换。可能与DNA的断裂和重接有关，故可 间接反映DNA损伤。31 原理：对于分裂的细胞，如将5溴脱氧尿 嘧啶核苷（BrdU）加入合成的原料中，经过 2个分裂周期，两条染色单体的其中一条的双 股DNA链中的胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代， 另一条只有一股被取代。此时，用染色剂如 吉姆萨和光处理，使双股含BrdU的染色单体 着色浅淡，而单股含BrdU的染色单体着色深 浓。在光镜下，可清晰分辨出发生交换的染 色单体。3233(七)基因芯片（Gene chip
12、；Microarray）1. 原理：基因芯片（DNA芯片）的生物学原理是根据遗传学中心法则，利用DNA分子可以变性、杂交的特性，在同一载体上同时进行多基因检测。简单的说就是高密度的斑点杂交 技术，是通过DNA芯片上固定的探针与游离的样品DNA杂交来推断未知的靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检 测。 A C T G-C-G-G-T-G-A-T- 34352. 操作流程l 从样本和对照细胞或组织抽提出总RNA。l 将总RNA纯化，提取mRNA。l 利用逆转录酶将mRNA逆转录为相应的cDNA。l 将对照的cDNA用CY3标记，样本的cDNA用CY5标记，并 将其等量混合制成混合探针。 l 用混合探针与芯片杂交。l 洗脱，晾干。 l 用激光共聚集扫描仪分别对CY3和CY5扫描，用图象处理 软件处理结果并做差减分析。（注：CY3及CY5是常用的荧 光标记物，特点是结构相似，不会影响杂交效率，并且激发 波长不同，可以做双波长测定。） 36四、致死突变试验方法的选择利用 1. 选择致突变试验的配套（test battery）原则：先短期，后长期；先体外，后体内；基因突变与染色体畸变兼顾；体细胞与生殖细胞兼顾。372. 试验结果综合分析阴性和阴性对照组的设立体外试验的活化系统（S9等）结果与致癌性一致与不一致的情况试验剂量的选择是否恰当38
