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1、第四章 酶的提取与分离纯化内内 容容 提提 要要1. 酶分离纯化的一般原则2. 酶提取方法的选择3. 酶纯化方法的选择4. 酶纯度的评价GoGoGoGoGo5. 酶的浓缩、干燥与结晶第一节 酶分离纯化的一般原则与蛋白质分离纯化过程相似，但有本身的特点。一、建立一个快速可靠的测活方法酶活力的测定，实质是测定酶的催化反应速度。1. 终止法测定酶活力：使酶失活，定时终止酶反应。 化学法：比色、酸碱测定和量热量气法计算酶的活性。 放射性化学法：底物用同位素标记，测定底物或产物的放射性 。 酶偶联法E1为待测酶活力，P1为E1产物，E2为指示酶，P2为E2产物。 P1 无光吸收或荧光变化，偶联后, P2
2、有光吸收或荧光变化。2. 连续法测定酶活力：不需要终止反应，只要跟踪反应过程 中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度和黏度的变化，即 可算出酶的活力。3. 酶活力的定义与表示方法酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U） 1961年国际酶单位（IU）：1分钟内转化1mol底物的酶量。1972年Katal（简称Kat）单位：每秒钟转化1mol底物的酶量 。 转换数：（TN or kcat)：在最适底物浓度时，单位时间里每个酶分子活性中心转换底物的分子数。 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质
3、浓度（mg/ml）二、原材料的选择1. 含酶量丰富2. 材料易得、价廉、预处理方便。3. 采用突变菌株或工程菌株。三、酶的提取胞内酶提取要采取适当的细胞破碎方法和缓冲液。四、酶的纯化1.总活力的回收率：越高越好。回收率每次总活力/第一次总活力2. 比活力提高的倍数：越多越好。3.纯化倍数：纯化倍数每次比活力/第一次比活力4.纯化步骤：越简单越好。第二节 酶提取方法的选择细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。一、酶分离纯化步骤酶的纯纯化过过程，约约可分 为为三个阶段：(1) 粗蛋白质 (crud
4、e protein): 采样 均 质打破细细胞 抽出全 蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白 质质以外的物质质。(2) 部分纯纯化获获得粗酶 (partially purified): 初步的纯纯化，使用各种 柱层析法。(3) 精酶 (homogeneous): 目标酶 的进一步精制纯纯化，可 用制备式电泳 或 HPLC 。二、生物材料的破碎许多酶存在于细胞内。为了 提取这些胞内酶，首先需要 对细胞进行破碎处理。1）机械破碎法：匀浆2）超声波法：防止热失活3）冻融法：防止酶作用4）渗透压法：除去细胞壁5）酶解破碎：溶菌酶等JY92-II D超声波细细胞粉碎机细细胞破碎珠高压细压细 胞破
5、碎机DY89-I型 电动电动 玻璃匀浆浆机机械破碎捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎冻融破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween酶促破碎自溶法 外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶 原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也
6、称为酶的抽提 。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行 提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有 机溶剂提取。 三、酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件。酶的主要抽提方法抽提方法使用的溶剂或溶 液提取对象盐
7、溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解 度较大的酶 酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大 ，且稳定性较好的酶 碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大 且稳定性较好的酶 有机溶剂提 取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水， 而且在低浓度的盐存在的条 件下，酶的溶解度随盐浓度 的升高而增加，这称为盐溶 现象。 第三节 酶纯化方法的选择1. 溶解度差异法2. 根据酶分子形状、大小差异分离法3. 根据酶分子电荷性质差异分离法4. 根据酶分子专一性结合的方法GoGoGoGo一、溶解
8、度差异法溶解度差异法是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶 的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的 技术过程。 溶解度差异法分离原理 盐盐析沉淀法（改 变离子强度）利用不同蛋白质在不同的盐浓 度条件下溶解度不同的 特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或 杂质 从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质 分离 等电电点沉淀法（ 改变pH值）利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同 的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节 溶液的pH值，使酶或杂质 沉淀析出，从而使酶与杂 质分离 有机溶剂剂沉淀法 （改变介电常数 ）利用酶与其它杂质 在有机溶剂中的溶解度不同，通 过添加一定量的某
9、种有机溶剂，使酶或杂质 沉淀析 出，从而使酶与杂质 分离 萃取分离法利用物质在两相中溶解度不同而使其分离的技术选择性变性沉 淀选择 一定的条件使酶液中存在的某些杂质变 性沉淀 ，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质 分离在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的 酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下 （KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法， 称为分段盐析。在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、 硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中
10、以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在 水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价 廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会 干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的 存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常 数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电 常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而 易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与 水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度 降低而沉淀析出。
11、常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。 萃取分离A. 有机溶剂萃取：采用水相和有机相（乙醇、丙酮、正丁醇和苯 酚等）。利用溶质在水和有机溶剂中溶解度不同而达到分离。B. 双水相萃取：利用酶在两相中的溶解度不同而分离。双水相：按一定百分比组成互不相溶的盐溶液或高分子溶液或 两种互不相溶的高分子溶液组成。C. 超临界萃取：超临界流体萃取，是利用欲分离的物质与杂质 在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体：在相同的温度和压力下，同一物质的气相和 液相的物理特性是截然不同的。当温度和压力达到某一数 值时，气体和液体的特性会趋于相同，这个数值称为超临 界点。当温
12、度超过其临界点时，两相变为一相，这种状态 下的流体称超临界流体。超临界流体的密度、溶解能力和液体相似；黏度、扩散系 数和气体相似。保证了萃取速度。各种双水相系统统聚合物P 聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙 烯醇，聚乙烯吡咯烷酮 ，羟丙基 葡聚糖，葡聚糖 聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 甲基纤维 素羟甲基葡聚糖，葡聚糖 乙基羟乙基纤维 素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖 聚蔗糖葡聚糖 聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸 钠，酒石酸钾钠某些超临临界流体的超临临界点和超临临界密度流体名称临界温度 ()临界压力 (Mpa)临界密度 （g/ml） 乙烷C2H632.34.880.203 丙烷
13、C3H896.94.260.220 丁烷C4H10152.03.800.228 戊烷C5H12296.73.280.232 乙烯C2H49.95.120.227 氨NH3132.411.280.236 二氧化碳 CO231.17.380.46 二氧化硫 SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326 笑气N2O36.57.170.451 氟里昂C28.83.900.5781、离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件
14、。常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 二、根据酶分子形状、大小差异分离法高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,称高速冷冻离心机。超速离心机的最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。
15、超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。蛋白质蛋白质分子在分子在离心时离心时，其分子量、分子密度，其分子量、分子密度、组、组成、成、形形状状等，均等，均会影响会影响其沉降速率，沉降其沉降速率，沉降系数系数即即用來描述此沉降用來描述此沉降性质；性质；其其单位为单位为 S (Svedberg S (Svedberg unit)unit)。（如：核糖体超速离心机对蛋白质大小。（如：核糖体超速离心机对蛋白质大小的描述。）的描述。）每一每一种种的沉降的沉降系数与系数与其分子密度或分子量成其分子密度或分子量成正比正比。
16、不同沉降不同沉降系数系数的的蛋白质蛋白质，可利用超高速，可利用超高速离离心心法，在密度梯度中作分法，在密度梯度中作分离离。l l温度类型：温度类型：常温及常温及 冷冻冷冻l l超速离心机均为超速离心机均为冷冷 冻型。冻型。l l使用冷冻离心机时使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离提前降温，预冷离 心头。心头。l l使用超速离心机时使用超速离心机时 先抽真空。先抽真空。n n 离心的形式离心的形式角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式及外摆式：外摆式一般为低速， 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。n n 角式离心机和离心头（转子）角式离心机和离心头（转子）l 角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧盖、旋紧l l材质：玻璃，材质：玻璃， 塑料塑料l l强度：和离心强度：和离心 速度相配速度相配l l大小：和转子大小：和转子 配套配套l l高速超速管要高速超速管要 加盖加盖离心管l平衡l
