浅谈hv基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望--hv基因定量分析技术的应用价值

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1、使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ hbv 基因定量分析的价值受到 越来越多研究者的重视 1。过去由于过分强 调了 hbv 感染后过强的细胞免疫应答介导 肝细胞损伤，忽视了对病毒复制水平与致病 性之间因果关系的研究。目前普遍认为，尽 管 hbv 不直接破坏寄生细胞，但病毒的活 跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反应的因 素。这表明确定感染者体内 hbv 复制状态， 即从 hbv 基因定量的角度作病情分析是十 分有意义的。事实上，真正引起人们关注 hbv 基因定量分析价值的重要原因是最近发 现了干扰素治疗与 hbv 基因水平两者之间 有非常密切的关系。hbv 基因定量分析还在 转基因动物

2、、基因治疗、蛋白疫苗和核酸疫 苗、抗 hbv 药物体外试验和动物试验及耐 药研究、流行病学研究、hbv 血液制品污染 监测等方面具有重要的应用价值。一、hbv 基因定量分析在干扰素治疗中的应 用尚无药物可以清除所有 hbv 感染者体内 hbv使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 生物制剂 2,它在病毒等诱导下由几种相关细 胞产生，并发挥抗病毒作用。但是无论使用 何种干扰素，也无论治疗剂量或疗程如何， 干扰素治疗后 hbv 转阴率迄今仍保持在 40%左 右，无法进一步提高，究竟有哪些制约因素 起作用尚无定论。近年来发现干扰素的治疗效果，即干扰素治 疗后的反应性(response)很大程

3、度上取决于 hbv 在体内的复制水平 2,3。以下几点事实 值得注意:治疗前 hbv 低水平复制者的反 应性明显优于高水平复制者。hbv 转阴的几 乎都是那些治疗前血清 hbv dna 含量较低者， 而治疗前 hbv dna 含量特别高者大多没有疗 效；治疗中病毒复制水平迅速降低者，有 望治愈。相反，治疗期间 hbv 基因水平下 降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者， 大多是无效者；治疗结束后，采用 pcr 定 量法检测，hbv dna 完全转阴者可能不再复 发，而终止治疗后 hbv dna 仍保持较低水平 者，反跳的可能性较大。可见，使用干扰素使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/

4、 hbv 感染时，在各种近期和远期疗效 指标中，除了病人的临床表现是否好转，生 化指标(alt)是否改善，肝组织炎症反应是否 减轻等以外，血清 hbv dna 定量分析是一个 十分重要的观察项目。从现有研究资料看， 除病理检查外，hbv dna 定量检测，也许是 干扰素治疗效果判断依据中最直接、最可靠 和最有价值的指标。多数研究者认为，通过 hbv dna 定量分析来指导干扰素治疗，有重 大意义。首先，在治疗对象的选择方面，即 确定干扰素治疗适应症时，应对各侯选病例 在某个时间段内定期反复检测 hbv dna 水平， 那些长期保持 hbv 高复制水平者不宜接受 干扰并素治疗，或应当联合治疗；其

5、次，干 扰素治疗期间，可根据 hbv 基因水平的动 态变化适时调整治疗剂量，决定是否缩短或 延长疗程，及是否终止治疗。这不仅对制订 合理的治疗方案，也对减轻病人负担，避免 不恰当用药有指导意义 4。笔者认为，目前 国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些 中高剂量治疗方案均缺乏充分和足够的立论 依据，有必要结合基因定量分析结果，重新使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 治疗结束后，对有反应者定期作定量分析， 有助于发现复发者，并根据血清 hbv dna 含 量波动情况决定是否实施再治疗。有人报告， 首次干扰素治疗有效者，再治疗的效果亦佳。 如果第一次治疗无反应或反应较差者，第二 次干

6、扰素治疗仍不能取得理想疗效 5。二、hbv 基因定量分析的其他临床价值hbv 感染后，在临床表现方面的差异非常明 显,可以表现为无症状携带者、急性肝炎、 慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬化及肝癌等多 种疾病状态。病毒在肝细胞内的复制水平与 各种临床疾病状态之间可能存在着某些必然 联系。由于 hbv 基因定量技术的发展和成 熟，目前已有可能从某些现象上阐明 hbv 复制与致病性之间的“量效”关系。“无症状携带者”可能为活动性乙肝患者 6。有部分 hbv 感染者，由于免疫耐受或其 它原因，体内 hbv 呈复制不活跃的“潜伏”状使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ mels 等研究发现无症状携带

7、者在其自然发 展史上，hbv 复制处于波动状态，时有加剧， 病毒复制积累到一定程度后 alt 水平增加。 一般规律是:血清 hbv dna 水平上升 alt 活 性增加 igm 抗 hbc 滴度提高。因此无症状 携带者应采取积极治疗措施，否则这类人群 不仅作为重要的病毒库传播 hbv，而且由于 隐匿性肝细胞损伤的不断积累，不经过慢性 肝炎阶段，直接向肝硬化和肝癌发展。hbv dna 水平与 hbv 感染者病情和预后的 关系密切。上述无症状携带者是一个特殊群 体。而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言， hbv dna 水平对预后判断有帮助。研究发现 hbv dna 一直保持较高水平的急性肝炎患者

8、易慢性化，而 hbv 复制水平较高的慢性肝 炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差，而且 肝组织炎症反应更明显，病情更重，更易发 生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清 hbv dna 水平来判断肝组织炎症损伤程度这类问 题上尚有争议。动物实验表明，鸭肝被使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 广泛感染的同时，并不伴随明显病毒 血症,肝细胞清除病毒的同时也无病毒血症 加重的证据 7。然而最近有人对 hcv 感染者 进行基因定量分析研究，发现 hcv rna 水平 与 alt 水平以及肝脏 knodell 分级之间有密 切关系 8。肝移植者 hbv dna 定量的意义mazzaferro 等报告肝移

9、植前患者血清 hbv dna 水平的高低决定移植后肝脏是否再感染 hbv9。作者观察到，14 例移植前血清 hbv dna 含量低于 103 拷贝/ml，移植后不间断 地采用 hbsab 免疫预防，随访 36 个月，无 一例再发肝炎，但另外两例移植前病毒拷贝 数大于 105/ml 则发生了严重 hbv 再感染。 建议移植前使用抗 hbv 药物，最大限度降 低血清 hbv dna 浓度，有助于防止 hbv 侵 犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果。前核基因突变 hbv 定量意义使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 前核基因突变可导致 hbeag 表达缺失。 感染不表达 hbeag 的 hb

10、v 突变株，或野生 型 hbv 在体内突变并成为优势株均产生较 严重的后果，如易发生暴发性肝炎，预后差， 干扰素治疗无效等 9,10。目前已能采用核 酸序列测定技术、pcr 技术、限制性片段长 度多态性(rflp)分析技术等来定性检测 hbv 前核基因突变。最近 baxall 建立了一种 pcr 及产物的显色反应点突变分析技术 (colourimetric point mutation assay)，用来 定量分析突变前核基因，有助于进一步探讨 hbv 突变与致病性之间的关系 11。基因定量分析是一项临床应用型技术，但对 基础研究也有一定的应用价值 12，尤其是 在当前基因治疗、转基因动物、核

11、酸疫苗等 热点研究领域，基因定量分析可能是一种很 好的辅助手段，对发现一些有意义的现象也 许有一定帮助。比如 hbv 在转基因小鼠组 织脏器分布规律可用定量标准来衡量，以及 用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它 物质对转基因小鼠 hbv 基因复制的调节作使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 力学变化的研究远未深入，如能采用定量手 段，分析抗原表达基因在体内的存在状态无 疑是有益的。至于各种抗 hbv 药物，无论 是在体外细胞模型(包括转基因细胞模型)还 是在动物模型的研究，或在人体研究，采用 基因定量分析，应当是考核药物疗效的最佳 手段 13。hbv 因定量分析存在的问题及未来展望

12、hbv 基因定量技术的发展历史不长，但由于 有定性技术为基础，以及与其它学科方法的 融汇，发展速度很快，目前趋于成熟。但应 用定量技术去研究 hbv 感染的临床问题还 不充分，同时定量技术本身也有许多问题值 得探讨。一、国际标准化。这是一个最为突出而又必 须尽快解决的问题。欧洲有一个“病毒性肝 炎研究组”（european study group in viral hepatitis)，经常向欧洲的某些研究机构提供使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 血浆标准品作定量分析参考 14。有必 要在国际上设立统一的 hbv 基因标准品， 包括各种 hbv 亚型的标准参照。笔者认为， 克隆的

13、 hbv dna 质粒不适宜作标准品。克隆 hbv dna 与载体构成了闭环超螺旋结构，而 且，一级结构单一，这与体内存在的 hbv 基因结构差异很大。后者呈部分双链，在血 清中尚有裂解片段及复制中间体等形式。因 此，无论是在分子杂交，还是在 pcr 过程中， 质粒 hbv dna 结构与人体内感染的 hbv dna 结构在杂交效率或扩增效率上必然有细微差 别，结果将影响定量分析的准确性。如从高 水平 hbv 阳性病人血清大量抽提，或从转 基动物血液中纯化得到 hbv dna，可能是一 个制备标准品的途径。总之，国际化的标准 参照，是保证 hbv dna 定量技术精确性和可 靠性的前提。二、分

14、子杂交定量技术和 pcr 定量技术应当 共存下去吗? 以下两点值得考虑:首先，有 必要弄清体内 hbv 复制水平极低者(如低于 1fg/ml)占 hbv 感染人数的比例有多大？这使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 于急性感染恢复期，或有自然清除病毒倾向 者，那么似无必要作常规 pcr 定量分析，定 期进行 pcr 定性检测即可。其次，有必要建 立一种敏感度介于分子杂交和 pcr 定量技术 之间的检测系统。最近有人利用电化学技术 观察到 dna 双链互补杂交，甚至单个碱基 对结合时发生了微电反应，这给我们以很大 启示，今后如有可能在这方面打开突破口， 那么基因定量分析两大技术共存的局面会发 生转变。但是，在目前这两大技术仍有很强 的互补性。