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1、 13.1 动物细胞融合技术 13.2 杂交瘤技术与单克隆抗体生产第13章 动物细胞融合和杂交瘤技术q动物细胞融合（cell fusion）又称体细 胞杂交(somatic hybridization)，是指 将不同来源的原生质体相融合并使之形成 新产品技术。q是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程 技术。动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用13.1 动物细胞融合技术 * * * * *细 胞 融 合培养基筛选新 产品细胞融合原理示意图q主要步骤：细胞靠近、细胞桥形成、胞质渗透、核融合。显微镜下细胞融合过程 引自：韩贻仁13.1.1 诱导细胞融合的方法q生物法病毒诱导
2、融合q化学法PEG诱导法q物理法电诱导融合法q (1)生物法病毒诱导融合q 基本原理： 仙台病毒（HVJ）具有凝集细胞的能力，并有促使凝结 的细胞发生融合的能力。 仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜上的磷脂成 分有关，而与病毒内核酸的活性无关。所以被灭活的病 毒或被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功 能。病毒促使细胞融合基 本过程：两个原生质体或细胞在病 毒粘结下靠近。通过病毒与原生质体或细 胞膜的作用使两个细胞膜 间互相渗透，胞质互相渗 透。两个原生质体的细胞核互 相融合，融为一体。进入正常的细胞分裂途径 ，分裂成含有两种染色体 的杂种子细胞。仙台病毒诱导细胞融合方法 ： （2）化
3、学法PEG诱导法PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 基本融合过程： PEG诱导融合的特点：优点：是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。（3） 物理法电诱导融合法q 基本原理： 在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜
4、瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。 基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液 中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过 溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶 极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直 流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接 触的细胞融合在一起。 关于融合参数：交流电压、交变电场的振幅频率、 交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉 冲次数等。 (4) 动物细胞融合影响因素u 融合方法 u 亲本细胞表面性质 u 细胞种类 u 细胞融合时的适宜温度和运动状态 u 氧含量
5、 u Ca2+ u PHq 13.1.2 融合细胞的筛选q（1） 杂合细胞类型 同核体：同源原生质的融合体。由于是同源细胞，他 们基因型及表现型完全一样。 异核体：非同源原生质的融合体。该杂种细胞含有双 亲全部细胞核和细胞质的物质。 多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关 系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主 ，只加入另外一个细胞少量的遗传物质。以及多个细胞 的融合体。q (2) 融合细胞的筛选方法遗传互补法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另外一亲本的缺陷，从而令杂种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。抗性互补法：利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及 其他毒性物质
6、抗性差异来选择杂种细胞。l 生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与培养条件反应的差异选择杂种细胞。如激素、氨基酸、碳水化合物营养成分要求不同，温度条件不同等。l 物理特性筛选法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度等差异选择杂种细胞。如用离心法可将异核体与亲本原生质体分开，从而获得融合体。l 荧光标记筛选法：用荧光激活细胞分选仪可自动分类和选择融合细胞。13.2 13.2 杂交瘤技术与单克隆抗体生产杂交瘤技术与单克隆抗体生产 什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞与抗体l B淋巴细胞受抗原刺激后，可
7、以产生抗体。l 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的 抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免 疫作用。l 每一个B淋巴细胞只能产生一种针对某一抗原 的抗体。l B淋巴细胞在体外不能增殖。u利用B淋巴细胞产生抗体的功能u利用肿瘤细胞无限增殖的特性u利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂合细胞 定义：肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，建立杂交瘤细胞系的技术称为杂交瘤技术。通常多指B细胞杂交瘤技术。 该技术将骨髓瘤细胞与B细胞融合，以建立能分泌针对某一种抗原的抗体的杂交瘤细胞系为目的，也称为单克隆抗体制备技术。 13.2.1 亲本选择 （1）瘤细胞：对
8、选择剂敏感，对数生长期细胞， 37，含5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。 （2）抗体生成细胞：采用腹腔注射抗原（细菌、病 毒或某种纯的蛋白），一般注射三次。使小鼠脾内 产生抗体，制备免疫脾细胞悬液。 （3）饲养层细胞的制备：用小鼠腹腔巨噬细胞作为 饲养细胞。 13.2.2 细胞融合（过程）l 将对数生长期的免疫脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞以10：1或5：1的比例混匀。l 离心，吸净上清液，加入40-50%的PEG，10-20min后加入培养液，终止PEG作用。l 离心，弃上清，用HAT选择培养液悬浮细胞，加到含饲养细胞的96孔培养板内，每孔100微升，37，5%CO2培养箱培养。l 融合细胞在3
9、-6天开始形成克隆，其余细胞逐渐死亡。 13.2.3 杂交细胞的筛选u筛选的原理与方法：普遍采用的HAT选择性培养液是在普通 的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A） 和胸腺嘧啶核苷（T）。u其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合 成途径（“1途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合 成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中， 叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋 呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“1途径”。u另一条途径是应急途径或补救途径（“2途径”），它是利 用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶脱氧核苷 激酶（
10、TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷 酸，两种酶缺一不可。因而只有具有这两种酶的细胞才能 在HAT培养基中生长。u因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细 胞融合的“1途径”被氨基喋呤阻断，虽“2途径”正常， 但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡 。u对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的 骨髓瘤细胞是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT）细 胞，因此自身没有“2途径”，且“1途径”又被氨基喋呤 阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。u惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞， 既具有效应B细胞的“2途径”，又具有
11、骨髓瘤细胞在体外 培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存 活下来，并不断增殖。 HAT液筛选后的融合杂交细胞要通过酶联免疫法、放射免疫测定法等方法进一步检测，筛选能分泌针对特定抗原产生特异性 抗体的杂交瘤细胞。 13.2.4 杂交瘤细胞的克隆培养 采用稀释铺板法和软琼脂培养法 13.2.5 单克隆抗体的生产l 将稳定的单克隆杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，从 腹水中分离、提取单克隆抗体。l 将杂交瘤细胞在培养瓶或生物反应器中离体培养 ，再从培养液中回收产生的抗体。单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞 细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，克隆培养足够数量的、能产生 特定抗体
12、的细胞群体外培养 注射到小鼠腹腔 单克隆抗体植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性， 植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导 原生质体融合使细胞分散后诱 导细胞融合 诱导方法物理（离心、振荡 、电刺激） 化学（聚乙二醇）物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒 用途获得杂种植株制备单克隆抗体单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强， 灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿 瘤资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗 体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病 、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一 个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和 定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤 追踪及心肌梗塞的诊断。思考题1. 什么是细胞融合？2. 动物细胞融合的主要方法有哪些？特点分别是怎样的？3. 用于动物融合细胞筛选的主要方法有哪些？原理是什么？4. 简述利用杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理和技术要点。5. 简述动物细胞融合过程及HAT培养液选择杂交瘤的原理。6. 比较动物细胞融合与植物原生质体融合技术的异同。
