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1、第二节 动物细胞培养动物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细细胞动动物细细胞 细细胞壁普遍存在存在 生长长速率0.10.5h-10.010.05h-1 需氧量高低 营营养要求普遍简单简单复杂杂 CO2需求一些微生物需CO2许许多需要CO2形成缓缓冲液环环境影响小大 大小范围围1002000nm10000100000nm 接种浓浓度低高（10-5.ml-1） 生长浓长浓 度高（1091010.ml-1）低（106.ml-1）一、动物细胞培养的特性动物细胞培养是指在合适的培养条 件下，动物细胞离体生长和增殖， 并保持其特性和功能的技术，这些 细胞不再形成组织。1 细细胞生长缓长缓 慢，易污污染，
2、培养需用抗生 素 2 细细胞大，无细细胞壁，机械强度低，环环境适 应应性差 3 需氧少，不耐受强力通风风与搅搅拌 4 群体生长长效应应，贴贴壁生长长（锚锚地依赖赖性 ） 5 培养过过程产产品分布细细胞内外，成本高 6 原代培养细细胞一般繁殖50代即退化死亡两个专业术语细胞系：首次分离组织的培养称之为 原代培养。原代培养物经传代成功后 即成细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从 原代培养物或细胞系中获得的具有特 殊性质或标记的培养物称为细胞株。细胞生长的类型贴壁依赖性来自动物实体组织的大多数 细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有 转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适 的固体介质上并铺展，才能生长。
3、非贴壁依赖性细胞无需贴附到固体介质 上就能生存和生长的细胞。来自血液、 淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为 非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。生长长特性：贴贴壁依赖赖型细细胞在培养时时 要贴贴附于培养（瓶）器皿壁上，细细胞 一经贴经贴 壁就迅速铺铺展，然后开始有丝丝 分裂，并很快进进入对对数生长长期。一般 数天后就铺满铺满 培养表面，并形成致密 的细细胞单层单层 。贴贴壁培养的优优点： 容易更换换培养液；细细胞紧紧密黏附于固相表面 ，可直接倾倾去旧培养液，清洗后直接加入新培 养液。 容易采用灌注培养，从而达到提高细细胞密度 的目的；因细细胞固定表面，不需过滤过滤 系统统。 当细细胞贴贴壁于生长长
4、基质时质时 ，很多细细胞将更有 效的表达一种产产品。 同一设备设备 可采用不同的培养液/细细胞的比例。 适用于所有类类型细细胞。.贴贴壁培养的缺点：与悬悬浮培养法 相比 扩扩大培养比较较困难难，投资资大； 占地面积积大； 不能有效监测细监测细 胞的生长长；二、细胞培养物的获得原代培养物在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的 组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水 解酶处理，使组织解离成单个细胞，放 入培养容器中无菌培养。这种原代培养 物中含有各种不同分化的细胞类型，它 们的生长速率不同，成纤维细胞最易生 长，常会在此后的传代培养中占据优势 。仔细控制培养基的成分，可以选择性 地支持某些细胞类型的生长。
5、转化细胞正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对 生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模 式的改变，二倍体变成异倍体。更典型的 表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及 细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞 仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。细胞转化有四种主要途径：有些细胞在 培养中自发转化化学转化。某些化学致 癌物会增加转化频率病毒转化。致瘤 因子转化转化细胞由于有无限寿命，在培 养中更易生长，被广泛用于生成 生物制品，如重组蛋白药物、病 毒疫苗等。但是，人们对她们的 安全性仍然非常关心，对可能造 成的生物危害性进行严格的检测 和控制。肿瘤细胞肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤 细胞与其它细胞融
6、合产生的细胞，如杂交瘤 细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基 本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的 增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖 程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。 。肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治 疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯 化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认 识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交 瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗， C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模 。体外培养所需的一般条件适宜的培养皿 血清成分 370C CO2595100湿度 抗生素培养基培养基配置考虑的因素的 pH 多数细胞系在pH7.4下生长得很好。 一些正常
7、的成纤维细胞系以7.47.7最好，转 化细胞系以pH7.07.4更合适。 缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生大 量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培 养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、 HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸N-2- Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid )温度 低温下CO2溶解度增加，引起pH 变化。黏度 培养基的黏度主要受血清含量的 影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损 伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基吡 咯烷增加培养基黏度细胞培养基的基本组成1、水细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水 的纯度要求很
8、高。通常细胞培养用水的污染物 标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应 高于注射用水标准。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖 很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更 偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要 的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它 的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。3、氮源氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞 合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可 少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的 种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到 的谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在
9、细胞 内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所 有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需 要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含 量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加 氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产 物产率。4、维生素维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要 生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基 或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。5、无机离子无机离子分为两组，一种是含量较高的， 包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压 平衡（Na+，Cl），作为酶的辅因子（Mg2+ ），促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作 用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素 ，如铁、锰、锌、钼
10、、硒、钒、铜。6、脂类和磷脂前体 在使用血清的细 胞培养中，脂类来自血清，在无血清培 养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固 醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞 ，对某种脂类有很高的依赖性。非营养性物质1、抗生素 细胞培养中，特别是原代细胞培 养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠， 常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与 510CO2平衡，否则培养基迅速变碱。 HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它 相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。3、酚红酚红普遍作为培养基的pH指示剂4、保护剂细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、 毒性金属和氧化剂所
11、引起的损伤的物质。在生物反 应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产 生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素 、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、Pluronic F68 、血清白蛋白，能够减轻这种损伤。5、还原剂某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。巯基乙醇 在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨 酸利用。血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马 血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是极其复杂的混合物，含有食物物 质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细 胞释放物质、采血中引入的污染物。由 于历史原因，商业培养基大都是按添加 血清来设计的，使用血清技术也很成熟 ，尽管使用血清有许多缺点，
12、仍将其作 为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。三、细胞计数及活力测定 培养的细细胞在一般条件下要求有一定 的密度才能生长长良好，所以要进进行细细 胞计计数。计计数结结果以每毫升细细胞数表 示。细细胞计计数的原理和方法与血细细胞 计计数相同。在细细胞群体中总总有一些因各种原因而死亡 的细细胞，总细总细 胞中活细细胞所占的百分比 叫做细细胞活力，由组织组织 中分离细细胞一般 也要检查检查 活力，以了解分离的过过程对细对细 胞是否有损伤损伤 作用。复苏苏后的细细胞也要 检查检查 活力，了解冻冻存和复苏苏的效果。用台盼兰兰染细细胞，死细细胞着色，活细细胞 不着色，从而可以区分死细细胞与活细细胞。 利用细
13、细胞内某些酶与特定的试剂发试剂发 生显显 色反应应，也可测测定细细胞相对对数和相对对活 力。四、培养物的污染及防止污污染途径 1 空气：空气流动动性大，如果培养操 作场场地于外界隔离不严严格或消毒不充 分，外界不洁洁空气很容易进进入造成污污 染。因此，培养设设施不能设设在通风场风场 所。无菌操作应应在净净化台内进进行，工 作时时要带带口罩2 器材：各种培养器皿3 操作：实验实验 操作无菌观观念不强，技术术不熟 练练，使用污污染的器皿或封瓶不严严等，都可以 造成污污染。 4 血清：有些血清在生产时产时 就已经经被支原体 或病毒等污污染，变变成了污污染。5 组织样组织样 本：原代培养的污污染多数来
14、源于组组 织样织样 本；取材时时碘酒消毒后脱碘不彻彻底，可 造成碘混入组织组织 ，细细胞或培养液中，影响细细 胞细细胞生长长。五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境1、温度 温度是细胞在体外生存的基 本条件之一，来源不同的动物细胞，其 最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的 最适温度是25280C，人和哺乳动物细 胞的最适温度是370C，细胞代谢强度与 温度成正比，超出最适温度范围，细胞 的正常代谢和生长将会受到影响，甚至 导致死亡。2、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因 素有三种：（1）缓冲液的缓冲能力及种类（2）对流空间大小（3）葡萄糖浓度培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO
15、2系统 ，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理 学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面 的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟 基离子。也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞 有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加 入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于 HEPES的pK为7.0，HEPES被加入后，其 缓冲能力为pH6.87.2。但是当HEPES 浓度高于25mmol/L时，它对大多数动物细 胞都有毒害作用。动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节 培养液中的pH：（1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂 及通入含CO2的空气进行调节（2）用0.1mol/LNaON或0.1
16、mol/LHCl进 行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌 和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时 会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细 胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动 物细胞培养时不太合适。通常通过调节培 养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来 控制发酵过程的pH。3、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧 是非常重要的。通气得得目的有 两个：一是提供细胞代谢所需的 足够的氧；二是使发酵液处于均 匀悬浮状态，有利于传质过程。（三）培养容器1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是常 用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易 放入培养箱内培养。2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在 滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培 养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养 箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入 微载体以增加培养表面积。3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设 备。它有各种不同形式，容积可以
