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1、关于生物技术综合实验报告关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)基因的克隆和原核表达学生： 学号：同实验者：谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH 具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。-GCS 是植物细胞中 GSH 生物合成的限速酶, 可以调控 GSH 的生物合成量。GSH 在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明 -GCS 也与植物抗逆过程密切相关。实验一 甘薯叶片 RNA 提取一、实验目的1. 了解真核生物 RNA 提取的原理；2. 掌握 Trizol 提取的方法和步骤。
2、二、实验原理Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总 RNA 的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持 RNA 的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。%的 8羟基喹啉可以抑制 RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅
3、速与核酸分离。-巯基乙醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA 处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀 RNA。用这种方法得到的总 RNA 中蛋白质和 DNA污染很少。三、实验材料1. 材料甘薯叶片，品种为徐薯 182. 试剂 无 RNA 酶灭菌水：加入%的 DEPC，处理过夜后高压灭菌； Trizol 试剂； 氯仿； 异丙醇、75乙醇； TBE 缓冲液； 上样缓冲液3. 仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和 EP管架四、实验方法1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每 5
4、0-100 mg 植物叶片加入 1 mL Trizol 试剂，室温放置 5 min，使样品充分裂解；2. 每 1 mL Trizol 试剂加入 200 L 氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置 3-5 min 使其自然分相；3. 4 12,000 rpm 离心 15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；4. 4 12,000 rpm 离心 10 min，弃上清，RNA 沉淀于管底；5. RNA 沉淀中加入 1 mL 75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4 8,000 rpm 离心 2 min，弃上清；6. 室温放置 10 min 晾干沉淀；
5、7. 沉淀中加入 20L RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解 RNA，-70保存；8. 用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用 EB 染色并照相。五、实验结果1. RNA 提取结果依照 Trizol 试剂盒方法，提出的 RNA 较少，此部分未以图或数据显示。2. RNA 后电泳结果如图 1. 其中 9a 为本组实验结果。由图可知 RNA 条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。图 1. RNA 提取跑胶结果。其中 1 泳道为样品Marker，9a 泳道为本小组 RNA 样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾
6、现象严重。六、分析与讨论1. RNA 的提取产量并不多，可能是因裂解样品不充分或 RNA 沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令 RNA 损失了部分，使最终 RNA 产量不理想。2. RNA 电泳结果有 EB 存在时，电泳后 28S rRNA 和 18S rRNA 在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由 tRNA， rRNA 和 5S rRNA 组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA 没有降解，则 28S rRNA 的亮度应为 18S rRNA 的 2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图 1. 9a 可知，RNA拖尾现象严重，说明 RNA
7、已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响 RNA 电泳结果。在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase 进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA 后本小组未立即将样品放入-70保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA 条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。七、总结：本次试验 RNA 提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1. 2a，3a，2b
8、 等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对 RNA 样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。实验二 第 1 链 cDNA 的合成和模板的验证一、实验目的1. 掌握第 1 链 cDNA 的合成方法和步骤二、实验原理真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟 mRNA。以真核成熟 mRNA 为模板合
9、成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的 DNA 序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。真核生物的 mRNA 都有 PolyA 尾巴。引物：Oligo dT。莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶以单链 RNA 为模板，在引物的引发下合成与模板互补的 DNA 链。mRNA 反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增称为 RT-PCR，RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏，对 RNA 的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。三、实验材料1. 材料徐薯 18 叶片 RNA 样品2. 试剂 dNTP mixture； Oligo (dT) Primer (
10、10 M)； Total RNA； RNase free ddH2O； M-MLV 反转录酶； 5First-strand Buffer； M DTT； Ribonuclease Inhibitor (40 U/L)3. 仪器10L 和 100L 的移液枪、的 EP 管、PCR 仪等四、实验方法1. 在 RNase free Microtube 管中配制下列混合液：dNTP mixture1 L*Oligo (dT) Primer (10 M) 4 LTotal RNA2 L生物技术综合实验报告实验一 工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌一、实验目的掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的
11、构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。二、原理培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。湿热条件(121的蒸汽，10 分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。三、器具和试剂灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH 试纸，培养皿，滤纸，Parafilm 封口膜。琼脂，MS 培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT ，1M NaOH 及 HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮 。四、 实验内容PH 调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备培养基的配制步骤1、取个干净烧杯
12、，加入 1/3-2/3 左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。3、用 NaOH 或者 稀 HCL 调剂酸碱值。4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。5、高压灭菌棉花无菌苗培养基的制备1、取 25 ml MS 大量元素母液，称取葡萄糖 15g、于 1升的烧杯中，定容后调 pH 值为，加入/l 琼脂煮沸。2、然后将其分装到 100 毫升的三角瓶中，每瓶 40 毫升。3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌 15 分钟。4、灭菌后臵于水平的工作台上冷却即可。要求：配制 1L拟南芥无菌苗培养基的制备1、拟南芥无菌苗培
13、养基：1/2 MS 大量元素+蔗糖10g/L，PH 值；加入琼脂高温高压灭菌。2、%琼脂糖：琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和%琼脂糖均 121高压灭菌 15 分钟。3、另准备 20 套 9cm 培养皿，灭菌。要求：配制，装 1 瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。五、注意事项1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻
14、璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。实验二 无菌苗的制备一、原理化学灭菌：%升汞(Hgcl2)溶液浸泡 10 分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84 消毒液浸泡 3 分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。 物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼 5min 左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。二、实验材料、器具和试剂棉花品种 YZ1;拟南芥 col-0 野生型 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。%升汞溶液，84 消毒液，75%酒精三、实验内容拟南芥无菌苗培养基倒皿1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基，稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸
15、，边煮边摇动，至全部融化。2. 将上次灭菌好的 9cm 培养皿分开放臵超净工作台上。3. 将融化好的培养基分装于培养皿中，将皿至于超净台上吹干.。共培养培养基的配制成分数量 成分 数量MS 大量元素 (20 倍） 50 ml 2,4-D (/ ml)1 mlNH4NO3 (20 倍) 50 ml 甘氨酸(1000 倍)1 ml微量元素 (100 倍)10 ml KT(/ml)1 ml铁盐 (100 倍) 10 ml 葡萄糖 30g/L微生素(1000 倍) 1 mlPH 值 肌醇 (100 倍) 1 ml依次加入上述物质，调 PH 值，然后分装至 2 个 500ml蓝盖瓶，每瓶加入 4g 琼脂
16、，灭菌，灭菌后倒皿。选择培养基的配制共培养培养基 +卡那霉素 50mg/L + 头孢霉素 400 mg/L灭菌后，待培养基凉至 60 度左右加入，混匀，倒皿。棉花无菌苗的制备1、将棉籽用手术剪刀去壳。2、用%的升汞灭菌 13 分钟。3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。4、28条件下暗培养 7 天 。拟南芥无菌苗的制备大量法灭菌：将拟南芥种子放入离心管中，加入 84 消毒液：无菌水=1:1 的混合液 1ml，上下摇晃灭菌 2min，弃消毒液；加入 1ml 75%的酒精混匀 1min，然后无菌水清洗4 次；加入%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基，吹干，封口。弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周。五、注意事项所有操作均在超净工作台上进行。六、实验结果一周后观察无菌苗的生长状况1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其余五瓶生长状况良好。2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。实验三 愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化一、实验目的
