电泳+DNA体外重组技术

《电泳+DNA体外重组技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《电泳+DNA体外重组技术（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、DNA体外重组技术 生物化学与分子生物学研究所概念是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组分子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。 步骤 1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体-分 2.构建、改造作为载体的DNA-切 3.目的基因与载体DNA在体外重组-接 4.重组DNA引入受体细胞-转 5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-筛replicationtranslationtranscriptionreplicationtranscriptiontranslation一、目的基因的获得 1.从染色体DN

2、A中直接分离 2.人工合成 3.由mRNA逆转录合成cDNA 4.从基因组文库中筛选目的基因 5.PCR获得 二、载体的选择 1.能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增； 2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆； 3.有一定的筛选标记，易于识别和筛选； 4.载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制； 5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子 、前导序列、增强子等调控元件； 6.生物安全性好。 可将外源DNA携带进入宿主细胞的DNA称为载体。常用载体l质粒l病毒l噬菌体三、连接 用DNA连接酶将目的基因与载体连接重组子。EcoRIEcoRI四、转化l把以质粒为载体

3、的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程称转化。以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程称转染。接受了重组DNA的受体菌称为转化子或重组体。l转化的方法l感受态细胞及其特点l注意事项 五、筛选 l在转化过程中,并非每个宿主细胞都被转化；即使获得转化的细胞,也并非都含目的基因，可能含有自身成环的载体分子、一个载体与两个外源DNA形成的重组子、或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。l因此转化后须在不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。Pseudo-positivepositive(一)根据重组子的遗传学特性筛选(平板筛选)

4、1.插入失活2.插入表达 3.营养素依赖表型 4.-互补(蓝白斑筛选法) (二)限制酶图谱筛选(电泳筛选法) (三)核酸杂交筛选 (四)免疫化学筛选筛选方法分子生物学实验安排第一次实验：质粒提取、鉴定（pGEX-2TK-SP1 /pUC18）。第二次实验：酶切质粒，回收目的片段，将目的 基因与载体连接。第三次实验：制备感受态，重组质粒转化E.coli 及表型筛选。表型筛选。l质粒概念：细菌染色体之外、能够独立复制、可赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA。 特性: 双链、闭合环状DNA，1-200kb；常含有编码某些酶的基因。l分型：严紧型与松弛型。l构型：超螺旋型SC-结构致密跑得快

5、电泳时最快。开环型OC-体积最大,不易从胶孔中穿过。线型LC-居中。 l分离: 将质粒与细菌的染色体DNA、RNA、蛋白等分离。碱裂解法、煮沸法、去污剂法等。实验一 质粒DNA的提取碱裂解法抽提质粒DNA的原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。分子大小 构型 pH12.6 pH4.8质粒DNA 小 环状 变性不完全 复性染色体DNA 大 环状 完全变性 不能复性操作流程l质粒提取见实验教材p89l质粒鉴定琼脂糖凝胶电泳 灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I) 加样：质粒+上样缓冲液混匀 电泳 结果观察：UV灯下电泳技术电泳的基本原理l带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反

6、的 电极移动的现象，称为电泳。l带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒 子向正极移动。l是生化与分子生物学的重要研究方法之一， 可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的 测定等。一 .定义l带有电荷的生物分子在电场作用下可发生移 动。由于混合物各组分所带电荷性质、数量 以及分子量各不相同，在同一电场作用下， 各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以 在一定时间内，它们移动距离不同，从而可 达到分离鉴定的目的。二.基本原理在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的 电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定 时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各 自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带 。这就是带电粒子可

7、以用电泳技术进行分离 、分析和鉴定的基本原理。-+泳动度l设一带电粒子在电场中所受的力为F，则F=QE （Q为粒子所带电荷，E为电场强度）l根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的 阻力F为： F=6rv （v为分子移动速度；r为分子半径；为介质黏度）l当分子达到动态平衡时，F= F即 QE= 6rv移项得 v/E=Q/ 6rv/E表示单位电场强度时粒子运动速度，称为 迁移率，也称电泳速度，以表示。 因此上式也可表示为： =Q / 6rl从上式可得到以下结论 带电粒子在电场中的移动与:粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快粒子的电荷有关，电荷愈多愈快粒子的形状有关，愈接近球形愈快三、影响迁移率

8、的因素1.电场强度电场强度是指每厘米的电位降凝胶两端距离20厘米，电压降200伏特 ，电场强度为10伏特/厘米电场强度越高电泳速度越快 2.溶液的PH值PH值决定带电颗粒的解离程度，决定 物质所带净电荷的多少3.溶液的离子强度缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢一般在0.02-0.2 4.电渗现象在电场中液体对固体支持物的相对移动纸或纤维素带负电荷，使其接触的水溶 液带正电荷，向负极移动。应尽量避免选用有电渗作用的支持物四、电泳的分类按电泳的原理来分，可分为二类：l自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没 有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂 ，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。l区带电泳

9、：是指有支持介质的电泳，待分离物 质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的 作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以 使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带 电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异， 又可分为不同的类型。支持物物理性质:滤纸及其他纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、粉末电泳、线丝电泳支持物装置形式分类：平板式电泳、垂直板式电泳、连续电泳、圆盘电泳按pH的连续性分类：连续pH电泳、非连续pH电泳琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。 琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只 有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的 分离、纯化及检测。其分辨率较高。v聚丙烯酰胺和琼脂糖

10、是目前实验室最常用的 支持介质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作 为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是 由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交 联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成 的。一、概述l优点聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有 弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度 变化小，没有吸附和电渗作用小的特点， 是一种很好的电泳支持介质。l分类聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形 式的不同，主

11、要有不连续聚丙烯酰胺凝胶 电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚 焦电泳和双向电泳等类型。琼脂糖凝胶电泳l特点 1.具有大量微孔孔径大小取决于浓度：0.075%浓度孔径800nm0.16%浓度孔径500nm1%浓度孔径150nm 2.具有较高的机械强度可以在1%或更低浓度下使用 3.无毒、不需要催化剂 4.具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易琼脂糖凝胶电泳优点1.双重效应：电泳效应、分子筛效应。 2.操作简单，电泳速度快，样品无需预处理。 3.电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 4.凝胶透明且无紫外吸收，可在紫外灯下观看结果 。 5.易染色，易洗脱，便于定量。琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分

12、离分析。琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖浓度% 线状DNA分子分离范围Kb0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2电极缓冲液TAE:40mM/L Tris-醋酸 1mM/L EDTA5:24.2克Tris5.7ml冰醋酸10ml 0.5M/L EDTA TBE:45mM/L Tris-硼酸 1mM/L EDTA5:54克Tris27.5克硼酸10ml 0.5M/L EDTA指示剂l溴酚蓝分子量约为670道尔顿，在不同溶液凝胶中，迁 移速度基本相同，其分子筛效应小，近似自由电泳。 在0.6%、1%、1.4%、2%的琼脂糖

13、凝胶电泳中，溴酚蓝 的迁移率分别与1000、600、200、150 bp 的双链线性 DNA片段大致相同l二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电 泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大 致相似 上样缓冲液（Loading buffer）l指示剂一般与蔗糖或甘油组成上样缓冲液。上样缓冲液的作用有：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置；l琼脂糖电泳时往往在样品中同时加入这两种指示剂，溴酚蓝指示小片段DNA，二甲苯青指示大片段DNA。琼脂糖凝胶配制实验安排上午：提取质粒下午：电泳鉴定碱裂

14、解法小量制备质粒DNA的方法1.将菌液转入1.5ml离心管中（尽量倒满）12000rpm 离心30s(沉淀菌体)2.原管中重复上述操作2次3.弃上清扣干，加入预冷的Solution I 100l，剧剧烈震 荡荡打散菌体，冰浴5min4.加入新鲜鲜配制的Solution II 200l，温和上下颠颠倒离 心管4次混匀，室温放置3min（此时时液体应应由浑浊变浑浊变 为为透明粘稠）5.加入预预冷的Solution III 150l，温和上下颠倒离心管 4次混匀，冰浴5min6.12000rpm离心10min，小心地将含有质质粒DNA的上清液 转转移至另一离心管中7.加入等体积氯积氯 仿，轻轻微振荡荡，12000rpm离心5min8.转转移上清液至另一离心管中，加入2倍体积积的冰冷无水 乙醇，轻轻颠轻轻颠 倒离心管混匀，室温放置5min9.12000rpm离心5min10.弃上清，加入70%乙醇洗涤涤沉淀，12000rpm，离心 5min11. 弃上清，液体尽量倒干净净，并在吸水纸纸上扣干12. 室温倒置离心管至质质粒干燥（15min以上）13.加入1TE 40l（含RNaseA）溶解质质粒，用于定量分 析，电电泳检测检测 等。