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1、第五章 微生物工程吴坚平浙江大学生物工程研究所 玉泉校区 教十-6201 E-mail: Tel:87952363（O）发酵工程发酵工程的概念发酵工程发展简史常用的工业微生物微生物选育微生物的营养和生长发酵生产流程和反应器主要微生物发酵产品发酵工程的概念发酵有三个层次的意义 1）细胞培养 2）微生物细胞培养 3）微生物在厌氧下转化糖为乙醇等有机物本章讨论的发酵过程主要是在生物反应器（发 酵罐）中以合适的条件培养微生物细胞，以细胞本 身或细胞代谢产物的生产为目标的过程。 发酵工程是研究发酵过程的工程学科。微生物工程：包括发酵工程，以及微生物在 环保、资源和能源利用、农业等领域的应用研究发酵工程
2、的目的：以尽可能低的成本大规模培养细胞，并高 效率的利用它们的代谢活动产出尽可能多的 产品。重要性：生物技术从实验室走向工业化上次 的必由之路。发酵工程的概念发酵工程发展简史古代对生物代谢作用的利用 新石器时代外高加索，葡萄酒生产 约公元前3000年古埃及和美索不达米亚地区（今伊 拉克），啤酒 约公元前2600年中国，龙山文化，酿酒 约公元前2400年埃及壁画，面包和酿酒 约公元前1000年中国，酱油酿造状况：知其然而不知其所以然龙山文化的陶制酒器蛋壳黑陶杯橙黄陶鬶古埃及关于啤酒的壁画发酵工程发展简史17世纪-19世纪（微生物学和遗传学起步）1664年Robert Hooke, 霉菌的显微镜观
3、察 1673年Leeuwenkoek, 细菌的显微镜观察 1856年Pasteur, 酵母导致酒精发酵 1857年Pasteur, 生物来自生物 1864年巴斯德灭菌法 19世纪末Koch, 纯种分离和培养技术霉菌的显微镜观察细菌的显微镜观察巴斯德画的酵母与乳杆菌Koch与纯种分离和培养技术发酵工程发展简史丙酮-丁醇发酵和甘油发酵 1914年英国Weizmann,丙酮-丁醇梭状芽孢杆菌 用途：丙酮可制造火药 首例大规模发酵 工业规模使用灭菌技术和纯培养技术 1918年德国Neuberg, 甘油发酵 通过加入硫酸钠使甘油产量提高、副产物 乙醇产量下降标志着生物工程的萌芽发酵工程发展简史青霉素的发
4、现和开发1928年Fleming发现青霉素 1938年Florey和Chain开始开发青霉素 老鼠试验人体试验 1941年青霉素的开发转移到美国 改变培养基菌种的筛选诱变育种 表面培养液体深层发酵 team work标志着生物细胞培养技术的成型青霉的杀菌现象表面培养液体深层发酵生物工程发展简史现代发酵工程的发展 1972年 首次DNA体外重组成功 1973年 DNA重组子表达成功，基因工程诞生 1978年 首个基因工程产品重组人胰岛素生产 成功，重组微生物的发酵成为发酵工程的 一个新兴研究领域微生物原核类:细菌、放线菌、蓝细菌 (过去称蓝藻或蓝绿藻)、 立克次氏体、衣原体和支原体真核类:真菌（
5、酵母菌、霉菌、担子菌） 原生动物和显微藻类不具细胞结构的病毒和类病毒等微生物是包括所有形体 微小的单细 胞，或个体结构 简单 的多细胞，或没有细胞 结构的低等生物的通称普通显微镜接物镜的工作原理细菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌致破伤风梭 菌真菌酵母青霉菌蘑菇 艾滋病病毒 T4-噬菌体冠状病毒病毒藻类藻青菌硅藻金藻草履虫钟形虫有孔虫原生动物 微生物的特点微生物的特点种类多、分布广体积小、面积大体积小、面积大吸收快、转化快生长旺、繁殖快易变异、适应性强有利于它们与周围环境进行物有利于它们与周围环境进行物 质交换和能量、信息交换质交换和能量、信息交换使微生物能迅速地生长使微生物能迅速地生长 繁殖，同时，能
6、为人类繁殖，同时，能为人类 生产大量的发酵产品生产大量的发酵产品对于危害人、动植对于危害人、动植 物的病原微生物或物的病原微生物或 使物品霉变的霉腐使物品霉变的霉腐 微生物，它们的这微生物，它们的这 个特性也给人类带个特性也给人类带 来了极大的麻烦和来了极大的麻烦和 祸害。祸害。典型的微生物 采样和筛选方法微生物育种技术诱变育种：物理（紫外辐射、电离辐射）化学代谢工程：基于代谢流分析和基因重组技术DNA重排和基因组重排育种菌种筛选方案平皿快速检测法示意图琼脂块培养法操作示意图微生物的营养和生长碳源：葡萄糖、蔗糖、糖蜜、乳清等氮源：无机氮源：氨、硫酸铵、尿素、硝酸盐有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、
7、玉米浆氧元素和氢元素无机盐生长因子：维生素、氨基酸、有机碱等发酵生产流程和反应器原料的预处理培养基的配制发酵设备和培养基的灭菌无菌空气的制备菌种的制备和扩大培养发酵发酵产品的分离纯化原料的预处理“粗粮”：粉碎酸水解，酶法水解氮源的预水解发酵培养基的配制和灭菌液体培养基：营养要求、pH纯种培养：灭菌蒸汽灭菌：121，20-30min，然后冷却必须注意控制营养成分不被破坏种子制备及发酵发酵过程的操作方式间歇发酵：也叫分批发酵或批式发酵生长曲线：迟滞期、对数生长期 稳定期、死亡期连续发酵：连续进料、连续出料困难：染菌、菌种变异（更多用于研究）流加发酵：介于上述二者之间，工业上常用发酵产品的分离纯化细
8、胞破碎（胞内产物）固液分离浓缩产物的初步分离产物的提纯和精制产物的最后加工和包装生物反应器搅拌罐鼓泡塔气升式反应器流化床反应器和填充床反应器发酵过程的检测和控制参数测量和调节过程的模型化和控制策略：动力学研究抗生素的生产抗生素概述抗生素一种有机物质能在低微浓度下有选择型地抑制 或杀灭某些微生物或肿瘤细胞的 有机物质由微生物、植物或动物等生物在 其生长活动过程中产生次级代谢产物是在 微生物细胞分化过程 中产生的，往往不是 细胞生长所必须的代 谢产物，对细胞生长 并不具有明显的作用抗生素概述抗生素的发展2500年前 用长在豆腐上的霉菌来治疗疮疖等疾病（中国）1870 发现某些微生物对炭疽杆菌有抑制
9、作用（法国）1928 发现并命名青霉素 （英国）1940 制备干燥的青霉素制品，并经过临床验证（英国）1943-45 抗生素工业发展，通气搅拌深层培养大规模生产1950- 农用抗生素研究1953 我国建立了第一个抗生素工厂1970- 抗生素品种飞跃发展从自然界发现和分离了共4300多种，实际生产并用于医疗约120多种，连同半合成抗生素衍生物及盐类共350种。其中以青霉素类、头孢菌素类、四环素类、氨基糖苷类及大环内酯类为最常用弗莱明 霍华德.弗罗里 抗生素概述抗生素的分类 (1)微生物是产生抗生素的主要来源，其中以放线菌产生的最多，占所有已发现的抗生素的一半以上。放线菌中又以链霉菌属产生的抗生素
10、为最多。抗生素概述抗生素的分类 (2)广谱抗生素 既能抑制革兰氏阳性菌，又能抑制革兰氏阴性菌抗生素的分类根据抗生素的化学结构分类具有重大的意义 化学结构决定了抗生素的理化性质、作用机制和疗效。许多抗生素的结构复杂，故按此分类时，不仅应考虑其整个化学结构，还应着重考虑其活性部分的化学结构。抗生素的分类 (3)抗生素的分类抗生素的分类 (4)抗生素的分类抗生素的分类 (5)常用的抗生素-1常用的抗生素-2常用的抗生素-3常见的抗生素- -内酰胺类抗生素-内酰胺类 抗生素a: 青霉素G； b: 头胞菌素 c: 噻烯霉素； d: 棒酸常见的抗生素-氨基糖苷类抗生素a: 链霉素； b: 庆大霉素氨基糖苷
11、类 抗生素a: 四环素(R1=R2=H)(Tetracycline); 金霉素(R1=C1，R2=H)(Chlorotetracycline)； 土霉素(R1=H， R2=OH)(Oxytetracycline)；b: 道诺红霉素(R1=H)(Daunorubicin)； 阿霉素(R1=OH)(Doxorubicin)常见的抗生素-四环素和蒽环类抗生素四环素和蒽环类抗生素a: 红霉素(Erythromycin)； b: 泰乐霉素(Tyrosin)常见的抗生素-大环内脂类抗生素大环内脂类 抗生素常见的抗生素-聚烯类抗生素两性霉素B Amphotericin B安沙霉素类抗生素常见的抗生素-安沙霉
12、素类抗生素抗生素的生物合成-氯霉素氯霉素的生物合成途径抗生素的生物合成-林可霉素林可霉素 的生物合成途径抗生素的生物合成放线菌素D放线菌素D 的生物合成途径抗生素的生物合成红霉素红霉素 的生物合成的最后几步抗生素的应用抗生素是人类使用得最多的一类药物，自从第二次世界大战期间青霉素正式投入工业化生产以来，已经有一百多种抗生素进行商品化生产，为人类的防病治病作出了重要的贡献。抗生素的应用医用抗生素的评价 差异毒性 （对宿主人体组织或正常细胞只有轻微毒性而对某些致病菌或突变肿瘤细胞又强大的毒害）抗生素的计量单位 效价单位 （单位体积培养基中完全抑制某种特定菌体的最小抗生素剂量）如：一个青霉素效价单位
13、为能在50ml 肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量；一个链霉素效价单位为能在1ml 肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌标准菌株的最小链霉素剂量抗生素的生产抗生素属于次级代谢产物微生物发酵法 （主要）化学合成法 （少数） 氯霉素、磷霉素等半合成法 将生物法制得的抗生素用化学或生化方法进行分子结构改造而制成各种衍生物，如氨苄青霉素等抗生素生产的工艺过程菌 种孢子制备种子制备发 酵发酵液预处理提取及精制成品包装将保藏的处于休眠 状态的孢子接种到 固体斜面上，培养 5-7日后，用扁瓶 在固体培养基上扩 大培养。抗生素生产 通用工艺培养基的配制前 体 在抗生素生物合成中，前体除直接
14、参与抗生素合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向，并增加抗生素的产量。前体的加入量应当适度，不足则发酵单位降低，过量则有毒性。如苯乙酸或苯乙酰胺可用做青霉素发酵的前体，丙醇或丙酸可作为红霉素发酵的前体。碳源、氮源、无机盐和微量元素有时，还需要加入某种促进剂或抑制剂，如在四环素发酵中加入M-促进剂和抑制剂溴化钠，以抑制金霉素的生物合成，并增加四环素的产量。培养基的发酵孢子培养摇瓶种子培养种子扩大培养发酵罐发酵一级种子二级种子三级种子抗生素的提取常用的抗生素提取方法：1. 溶媒萃取法： 利用抗生素在不同pH条件下，以不同的化学状态（游离酸、碱或成盐）存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中 溶解
15、度不同的特性，使抗生素从一种液相转移到另一种液相中去 ，以达到浓缩和提纯的目的。2. 离子交换法： 利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，将抗生素吸附在离子交换树脂上，应选用对抗生素有特殊选 择性的树脂。此法成本低、设备简单、操作方便，已成为提取抗 生素的重要方法。3. 直接沉淀法： 提取抗生素的最简单方法。抗生素的精制A. 脱色和去热原精制注射用抗生素中不可缺少的一步，关系到成品的色级及热原试验等质量指标。（热原是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体， 能溶于水，注入体内引起恶寒高热，严重时引起休克。生产中常 用活性炭去除热原。）B. 结晶和重结晶常用此法来制成高纯度抗生素成品。 改变温度结晶
16、； 利用等电点结晶； 加成盐剂结晶； 加入不同溶剂结晶。抗生素的精制青霉 素的 生产 工艺青霉素的生产工艺-菌株-1青霉素生产菌株：产黄青霉菌 青霉素的生产工艺-菌株-2分生孢子的期 菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，有类脂肪 小颗粒产生的期 细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细 胞的期等六个阶段 原生质嗜碱性仍很强，形成脂肪粒，积累 贮藏物的期 原生质嗜碱性很弱，脂肪粒减少，形成中 、小空孢的期 脂肪粒消失，形成大空孢的期 期称为 菌丝生长期， 产青霉素较少 ， 菌丝的浓度增 加很多 期称为 青霉素的分泌 期，菌丝生长 趋势减弱，产 生大量青霉素 菌丝自溶期 青 霉 菌 的 生 长 发 育 青霉素的生产工艺-培养基碳源 氮源 前体 无机盐 多种碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等
