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1、基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室细胞生物学教研室李 丰李 丰 研究某一目的基因功能一般策略 目的目的DNADNA获得来自三条途径获得来自三条途径: :l l1.1. genomegenome上的特定区域或序列上的特定区域或序列l l2. 2. 含有目的含有目的DNADNA的质粒的质粒l l3. 3. 从从cDNAcDNA文库中扩增单个已知文库中扩增单个已知 cDNAcDNA获得目的获得目的DNADNA构建含目的构建含目的 DNADNA质粒质粒转化细菌转化细菌蛋白表达纯化蛋白表达纯化转染真核细胞转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化第一部分 PCR聚合酶链反应（PCR）技
2、术 l l聚合酶链式反应聚合酶链式反应( (Polymerase Polymerase Chain Chain ReactionReaction ，PCR)PCR)是是2020世纪世纪8080年代后期由年代后期由K.MullisK.Mullis等建立等建立 的一种体外酶促扩增特异的一种体外酶促扩增特异DNADNA片断的技术。片断的技术。l lPCRPCR是利用针对目的基因所设计的是利用针对目的基因所设计的一对特异一对特异 寡核苷酸引物寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的，以目的基因为模板进行的DNADNA 体外合成反应。体外合成反应。l lPCRPCR技术具有灵敏度高，特异性强，操作简技术具有
3、灵敏度高，特异性强，操作简 便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各 个领域。个领域。一、PCR实验原理一、PCR实验原理二、PCR的反应体系1. 1. PCRPCR引物引物（1 1） primer primer 长度：长度：18-18-3030bpbp引引物短物短特异性降低特异性降低引物长引物长影响产物生成影响产物生成（2 2） primer primer 浓度：浓度：0.1-1.0.1-1.0 0 umolumol/L/L浓度过高浓度过高错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加浓度过低浓度过低PCRPCR效率降低效率降低二、PCR的反应体系2. 2.
4、 缓冲液缓冲液 KClKCl、TrisTris- -ClCl、MgClMgCl2 2 ， MgMg2+2+：1.51.52.0 2.0 mMmMMgMg2+2+ : :DNADNA聚合酶聚合酶 活性活性 PCRPCR产量产量MgMg2+2+ : PCR: PCR反应特异性反应特异性二、PCR的反应体系3. 3. DNADNA聚合酶聚合酶TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 LA DNALA DNA聚合酶聚合酶 Prime STAR Prime STAR ( (PyrobestPyrobest DNA DNA聚合酶聚合酶 ) )PfuPfu DNA DNA聚合酶聚合酶Taq DNA poly
5、merase553353355 5 3 3 DNADNA聚合酶活性。在模板和引物存在的条聚合酶活性。在模板和引物存在的条 件下，以件下，以dNTPdNTP作为底物，沿作为底物，沿5 5 3 3 方向合成与模方向合成与模 板互补的板互补的DNADNALA LA TaqTaq DNA Polymerase DNA Polymerase 1 1. . 553 3 DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性；2. 2. 3 35 5 DNADNA外切酶活性。外切酶活性。Pyrobest & pfu DNA Polymerasel lTaqTaq DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性l l3 35 5 外切酶活
6、性，可信度极高外切酶活性，可信度极高l lPCRPCR产物为平滑末端产物为平滑末端PCR的反应体系4dNTP: 50-200 umol/L 5. 模板DNA （1） 单链DNA （2） 双链DNA （3） 浓度：基因组DNA：1ug 质粒DNA：10ng三、基本操作步骤l1. 变性变性( (denature)denature):95高温下,双螺旋氢键断 l 裂,双链DNA解链成为单链DNAl2. 退火退火( (annealing)annealing):两条引物与模板DNA扩增区 l 域的两端按碱基互补配对结合.l3. 延伸延伸( (extension)extension):在4种dNTP底物及
7、Mg2+存在l 条件下,Taq DNA聚合酶在72下,将单核 l 苷酸按碱基互补配对原则从引物3端 掺l 入,使引物沿53方向延伸合成新 股DNA四、条件优化l l1.1. 变性变性: : 9595变性变性20-3020-30s,s,即可使各种即可使各种DNADNA完完 全变性。全变性。l l2.2. 退火退火: :引物与模板退火温度由引物长度和引物与模板退火温度由引物长度和 GC%GC%决定决定, ,退火温度一般应比退火温度一般应比TmTm值低值低4-4-12 12 为宜为宜 , ,退火时间一般为退火时间一般为20-20-4040s s。l l3.3. 延伸延伸: :通常通常68-7568-
8、75。延伸时间取决于扩增。延伸时间取决于扩增 片断的长度片断的长度. . 可以可以500500bp/30sbp/30s为基准，根据目的为基准，根据目的 片断的长度计算反应时间。片断的长度计算反应时间。l l4.4. 循环次数循环次数：一般为：一般为25-3525-35次。次。PCR反应液l lPCR BufferPCR Buffer（MgMg2+2+） 2.5l 2.5ll ldNTPdNTP混合物（各混合物（各2.52.5mMmM） 4l 4ll l模板模板DNA DNA 1l 1ll l引物引物1 1（2020uMuM） 0.5l 0.5ll l引物引物2 2（2020uMuM） 0.5l
9、 0.5ll lTaqTaq DNA polymerase DNA polymerase（5U/ul5U/ul） 0.25l 0.25ll lddHddH2 2OO至至 2525llPCR反应条件94 5minl94 30secl55 30sec 30 Cyclesl72 1minl72 10minl 4 forever五、PCR引物的设计l lPCRPCR反应成功的一个关键条件是正确反应成功的一个关键条件是正确 设计引物设计引物l lPCRPCR引物设计目的是在扩增特异性和引物设计目的是在扩增特异性和 扩增效率两个目标上取得平衡扩增效率两个目标上取得平衡. .l l可以利用计算机软件进行引物
10、设计可以利用计算机软件进行引物设计, ,引引 物设计软件会通过每一引物设计变化的物设计软件会通过每一引物设计变化的 预定值在两个目标间取得平衡预定值在两个目标间取得平衡, ,找出最佳找出最佳 引物引物. .l l有时也需根据实验的具体要求进行适当有时也需根据实验的具体要求进行适当 调整调整. .引物设计的基本原则 l l( (一一) )引物长度引物长度l l在在16-16-3030bpbp范围内范围内, ,以以18-2418-24bpbp为最佳为最佳. .l l引物过短引物过短, ,产物特异性降低产物特异性降低, ,每增加一个核每增加一个核苷酸苷酸, ,引物特异性可增加引物特异性可增加4 4倍
11、倍. .l l引物的长度是指与模板引物的长度是指与模板DNADNA序列互补的部分序列互补的部分, ,不包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序不包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列列. .引物设计的基本原则l l( (二二) )引物末端引物末端l l1.1.引物的引物的3 3末端对于末端对于PCRPCR反应是关键反应是关键. .l l2.2.引物的引物的3 3末端的第一和第二个碱基影响末端的第一和第二个碱基影响 TaqTaq DNADNA聚合酶的延伸效率聚合酶的延伸效率, ,故其影响故其影响PCRPCR反应反应 的扩增效率及特异性的扩增效率及特异性. .引物引物33末端最佳碱基末端最佳碱基 选择
12、选择G G或或C C，因为它们形成的碱基配对比较稳因为它们形成的碱基配对比较稳 定。定。引物设计的基本原则l l3.3. 引物引物5 5末端的碱基无严格限制末端的碱基无严格限制l l当引物的长度足够时当引物的长度足够时, , 引物引物5 5末端的末端的碱基可不与模板碱基可不与模板DNADNA互补而呈游离状态互补而呈游离状态。可在。可在5 5端加上限制内切酶位点端加上限制内切酶位点, ,启动启动子序列或其他序列等子序列或其他序列等, ,以便于以便于PCRPCR产物的产物的分析克隆。分析克隆。引物设计的基本原则l l4.4.在一个在一个PCRPCR反应中的一对引物之间反应中的一对引物之间不应存在互
13、补序列不应存在互补序列, ,特别是特别是3 3末端应尽末端应尽量避免互补量避免互补, ,以免形成以免形成“引物二聚体引物二聚体”造成引物浪费和非特异性的扩增造成引物浪费和非特异性的扩增. .l l5.5.每个引物的内部应尽量避免形成二每个引物的内部应尽量避免形成二级结构级结构, ,特别是引物的末端应无回文结特别是引物的末端应无回文结构构. .引物设计的基本原则l l( (三三) )引物的引物的GCGC含量和含量和TmTm值值l lPCRPCR引物引物G+CG+C碱基的含量应保持在碱基的含量应保持在45-6545-65% %之间之间 ，G+CG+C含量一般为含量一般为40-60%40-60%。其
14、。其TmTm值是寡核苷酸值是寡核苷酸 的解链温度，即在一定盐浓度条件下，的解链温度，即在一定盐浓度条件下，5050% %寡寡 核苷酸双链解链的温度。核苷酸双链解链的温度。l lPCRPCR扩增中的复性温度一般是较低扩增中的复性温度一般是较低TmTm值引物值引物 的的TmTm值减去值减去5-105-10度。引物长度小于度。引物长度小于2020bpbp时时, , Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T) 。引物设计的基本原则l l( (四四) )引物的位置引物的位置l l1.1.引物的序列应位于基因组引物的序列应位于基因组DNADNA的高度保守的高度保守 区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少 引物与基因组的非特异结合，提高反应的特引物与基因组的非特异结合，提高反应的
