狂犬病实验室检测技术

《狂犬病实验室检测技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《狂犬病实验室检测技术（43页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、狂犬病实验室检测技术1 一、实验室操作前的要求及准备 二、实验室检测方法2实验室操作前的要求及准备（一）实验室条件及生物安全操作要求（二）检测标本的要求（三）实验前准备3（一）实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人员需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。2、P2实验室操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行(实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。3、P3实验室对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3 以上条件的专业实验 室中进行。 没有P3 实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。44、个人防护实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套，作好技术上

2、的准备。5、防止气溶胶扩散由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作 应在密闭状态下进行。6、实验后消毒处理实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯 仿、丙酮），4570%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对 操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。51、采集时间 （1）应尽量采集较新鲜的标本。（2）采集时无菌操作，避免标本污染 2、标本保存（1）尽量低温保存（2）存放于无菌离心管中并进行编号。 3、标本类型（1）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。（2）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于 病原学检测

3、，其中以脑组织中的阳性率最高；血清和脑脊液可用于抗体的检测。（二）检测标本的要求6（三）实验前准备 1、实验室及仪器的准备（略） 2、各种试剂及材料的准备（略） 7实验室检测方法 （一）DFA 法 （二）巢式 PCR 法 （三）其它检测方法 （四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法 （五）美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法 8（一）DFA 法（直接荧光抗体法）检测狂犬病毒抗原 免疫荧 光技术Ab优点Ag(尤其是不产生 细 胞病变的病毒安全快速简便敏感性和特 异性较高9荧光抗体的染色方法可分为两类： 直接法 荧光抗体直接与标本内的抗原反应,优点简便、快捷、有效减少非特

4、异性染色,只适用于检测细胞内的抗原； 间接法 荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应,既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体相对直接法操作步骤增多DFA原理：抗体蛋白分子+ + 抗原形成抗原抗体复合物通过荧光显微镜检测抗原荧光素10操 作：1、材料和仪器 2、操作步骤 i. 印片： 用酒精浸泡载玻片 30 分钟后取出、吹干，分别取不同部位的脑组织剖面, 均匀的涂印在载玻片上；ii. 固定：吹干后，取冷丙酮（4）室温固定 710 分钟；取出吹干，进行步骤3，或置于 70冰箱保存； iii. 加荧光抗体：将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上（如果从 冰箱中取出，则待雾气散

5、掉后再进行此步骤。）； 11iv. 孵育：将抗原片放在湿盒中， 37温育30 分钟； v. 洗片：取出后，用缓流冲洗抗原片 35 秒，再用 PBS 振洗 2 遍，蒸馏水振洗 1遍，每次 2 分钟，吹干； vi. 封片镜检：用 90甘油（ PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。 搅拌器及染色缸 12结果判断：仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：阴性、可疑、 ：无荧光； /：极弱的可疑荧光； 无荧光“” 13 ：荧光较弱，但清晰可见；14 ：荧光明亮，且多个视野均有分布；15 ：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰，且 范围广泛；荧光强度“” 荧光强度“”161

6、7（二）巢式 PCR 方法检测狂犬病毒核酸 传统的 PCR 检测模式一般需要三个步骤： 制备模板：对待测标本进行核酸（DNA或 RNA）提取 扩增过程：采用 PCR 或 RT-PCR 技术对核酸进行变性、退火、延 伸扩增； 检测过程：通过电泳等方法对PCR产物进行检测。 Sample Extract RNA or DNA PCR Electrophoresis photograph18巢式 PCR（nestedPCR）：巢式 PCR的原理：是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上 ，通过二次 PCR 反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过循环扩增后，将

7、第一次 扩增的产物作为模板进行第二次扩增。优点： 特异性、灵敏度均比常规 PCR好。缺点： 比常规 PCR易污染。19巢 式 PCR 方法的操作： 1、RNA 提取：Trizol 法 （1）以下步骤在 P2 生物安全柜中进行取不同位置的少量脑组织（50-100mg） 1000 l Trizol 先加 200 l（研磨均匀）然后加满至 1000 l 液体（唾液、尿液等）取 250 l 750 l Trizol LS -70过夜或颠倒 Epp 管 3040 次以便充分混匀内容物， 室温放置 5 分钟 （此步完可-70保存 1 个月） 20 （2） 以下步骤可在普通实验室进行 -70取出，室温融化加

8、 200 l 氯仿， 快速颠倒 Epp 管数次（30 秒），使其呈淡粉红色 室温放置 3min 4离心，12000rpm，15min （其间标记新的离心管，每管中加 600 l 异丙醇） 取离心后水相 600 l，加入新的离心管中，轻柔混匀 室温放置 10 min （20放置 30 分钟效果更佳） 4离心，12000rpm，10min 21缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，可见少量沉淀 加 1ml 75乙醇（DEPC H2O 新鲜配制）洗涤沉淀 4离心 12000rpm，10min 缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，室温干燥数分钟 （加入 75乙醇至70可长期贮存 12 年） 脑组织的

9、沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 个 EPP 管分装) 液体（唾液、尿液等）的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中 直接进行逆转录或70贮存 22注意事项： 1. 操作时一定戴口罩手套，保证离心管枪头无 RNA 酶 2. 一次提取核酸，样本数不要太多（10 个左右） 3. 加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确， 否则容易降低提取效率 4. 异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果 5. 加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔，加液体时贴壁缓流，以免破坏到所提核酸 6. 尽量缩短 RNA 在空气及室温的暴露时间，水溶的 RNA 一定要低温 保存 7. 标本及时放回-20

10、或-70 232、逆转录合成cDNA1）pd(N)6 稀释至 0.2ug/ul2）水浴预热至 65（其间标记反应管） 3）33ulRNA 液 65水浴 10min（其间准备冰盒或碎冰）4）冰浴 2min，瞬时离心。5）将液体转移至试剂盒反应管中 32ul，先不要混匀。6）再向反应管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特异引物各 0.5ul，使总体积达到 33ul，室温 1min，混匀，瞬时离心。 7）37水浴，60min 8） -20或-70保存 cDNA 243、巢 式 PCR：2526琼脂糖凝胶电泳 1电泳槽中注入缓冲液 TAE 2将做好的琼脂胶放入电泳槽（加样孔在负极方向）

11、 3Marker 加 5 ul，样品加 10ul 5电压：100V6时间：30min 照相：凝胶成像仪/紫外透射仪27（三） 其它检测方法1、ELISA检测抗原：包被抗体：用pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG 包被96 孔酶标板 ，4过夜； 封闭：用含0.3牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6 碳酸盐缓冲液封闭30分钟； 加待检标本：将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS制成30的悬液，离心取上清加 入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 l/孔，37孵育1 小时； 洗板：洗板四次； 加酶标抗体：后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200l/孔，37 l 小时； 洗板

12、：同上； 加底物：加入酶反应底物，室温作用30 分钟； 终止反应：加2M H2SO4 终止反应； 观察结果：肉眼观察或酶标仪测定结果。282、荧光灶抑制试验检测中和抗体 中和抗体： 为疫苗免疫力程度的评判指标 中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保护 快速荧光灶抑制试验（RFFIT）： 为WHO 推荐的检测方法 制备细胞悬液( 110 cells/ml 的 BSR 细胞悬液) 稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS 株）中和血清和病毒( 0.1ml血清 和标准病毒稀释液0.1 m1 ，37中和1.5 小时)检测剩余病毒(每孔加入 50 l 制备

13、好的细胞悬液，37、5% C02 过夜培养)固定(弃掉培养液，PBS 洗一次，丙酮固定)荧光抗体检测(干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37 30 分钟)观察结果( PBS 洗3 次，荧光显微镜观察结果)计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制50的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度)步骤293、病毒分离A. 细胞培养法分离病毒 研磨标本 制成悬液（用PBS 或MEM ，30 ） 离心（ 4 2000r/min 离心20 m） 取上清接种细胞（鼠神经瘤细胞、Vero 细胞 或BHK21 细胞） 吸附（ 2 h） 加维持液 孵育(37 、5 C02 、45 天) 鉴定鉴定 B. 乳

14、小白鼠接种法分离病毒 研磨标本 制成悬液 离心 取上清接种乳鼠脑内（ 12 日龄 ） 饲养 观察发病情况观察发病情况( (未发病的鼠保留至21 天后作DFA检测)304、ELISA检测狂犬病毒抗体 ELISA方法测定的是总抗体，不代表具有保护性的中和抗体水平 其结果仅供参考。5、染色镜检检测内基氏小体31（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法1、DFA法检测狂犬病毒抗原 意义：阳性结果，表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。2、ELISA检测狂犬病毒抗原 意义：检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法分离狂犬病毒 意义：阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。324、RT-PCR检测狂犬病毒核酸原理：狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成 一条cDNA链（RT）,再进行PCR。 检测步骤：1）病毒RNA的提取2）逆转录合成cDNA3）PCR扩增4）电泳 意义：阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。335、狂犬病特异性抗体检测 狂犬病特异性抗体：在自然感染情况下，狂犬病毒通过带有病毒的动物唾液进 入机体伤口在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流） 故 不能形成病毒血症。在感染后，狂犬病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触 故机体无免疫应答反应（针对狂犬病毒