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1、第二十二章第二十二章 免疫学检测免疫学检测 技术的基本原理技术的基本原理1主主 要要 内内 容容n n抗原和抗体的体外实验抗原和抗体的体外实验n n免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定2n 免疫学检测技术：免疫学检测技术：运用免疫学原理设计的检测方法运用免疫学原理设计的检测方法可用于：可用于： 诊断免疫相关性疾病诊断免疫相关性疾病探讨发病机制探讨发病机制监测病情和治疗效果监测病情和治疗效果3第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测对感染性疾病的诊断：对感染性疾病的诊断：n n感染早期：查病原体（抗原）感染早期：查病原体（抗原）n n感染晚期：检测特异性抗体感染晚期：检测特异性抗体抗原抗体
2、的检测方法抗原抗体的检测方法= = 血清学方法（血清学反应，血清学方法（血清学反应，serological reactionserological reaction） 用已知用已知 Ag Ag 检测未知检测未知 Ab(?)Ab(?) 用已知用已知 Ab Ab 检测未知检测未知 Ag(?)Ag(?)4一、抗原抗体反应的原理：一、抗原抗体反应的原理：（一）特异性：（一）特异性：AgAg（表位）与表位）与Ab(CDR)Ab(CDR)的结合的结合可逆性：可逆性：非共价键结合非共价键结合（二）可见性：（二）可见性：AbAb与与AgAg的比例合适的比例合适 形成肉眼可见聚合物形成肉眼可见聚合物。阶段性：阶
3、段性：特异性结合阶段：几秒特异性结合阶段：几秒 几分钟几分钟可见反应阶段：可见反应阶段：几分钟几分钟 几小时几小时 几十小时几十小时5影响抗原抗体反应的主要因素：影响抗原抗体反应的主要因素： AgAg与与AbAb的浓度、的浓度、 比例比例 电解质电解质: : 0.85%NaCl0.85%NaCl 温度温度: 37: 370 0C C 酸碱度酸碱度: : pH=6-8pH=6-8AgAg浓度浓度Ag Ag AbAb复合物复合物前带前带后带后带等价带等价带6抗原与抗体的种类：抗原与抗体的种类：n n抗原的类型：抗原的类型：n n颗粒性抗原：颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球细胞，细菌，人工微球/ /
4、珠珠n n可溶性抗原：可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合细胞成分，蛋白分子，小分子化合 物物7n n抗体的类型：抗体的类型：n n多克隆抗体多克隆抗体( (抗血清抗血清): ): 识别多个表位，特异性识别多个表位，特异性差差n n单克隆抗体：单克隆抗体：识别单个表位，识别单个表位， 特异性好特异性好n n抗抗- -抗体（二抗）：抗体（二抗）：抗异种抗异种IgIg的抗体的抗体8二、抗原或抗体的检测方法二、抗原或抗体的检测方法（一）凝集反应：（一）凝集反应：（agglutinationagglutination）颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与免疫无关的载体
5、上）与相应抗体在适当条免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条件下形成肉眼可见的凝集小块。件下形成肉眼可见的凝集小块。91 1、直接凝集反应：、直接凝集反应： 天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应 抗体直接结合所出现的凝集现象抗体直接结合所出现的凝集现象 ：（1 1）玻片法）玻片法定性试验：定性试验：已知已知 Ab Ab 未知未知 Ag(?)Ag(?)ABOABO血型鉴定，血型鉴定， 细菌种属抗原型别的鉴定细菌种属抗原型别的鉴定+10（2 2）试管法）试管法半定量试验：半定量试验：诊断伤寒副伤寒的诊断伤寒副伤寒的“ “肥达氏反应肥达氏反应” ”病人血清病人血清 倍比
6、稀释倍比稀释伤寒细菌悬液伤寒细菌悬液1:21:41:81:161:321:64对照112 2、间接凝集反应：、间接凝集反应：+载体：载体：红红 血血 球：球： 间接血凝试验间接血凝试验12（二）沉淀反应二）沉淀反应 ( (precipitationprecipitation) ) ：可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在 适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀 线）。线）。1 1、单向免疫扩散、单向免疫扩散(radical (radical immunodiffusionimmunodiffusion) )：可定量检测可定量检
7、测AgAg13含抗人含抗人IgGIgG琼脂琼脂 制成平板制成平板待测血样待测血样( (IgGIgG浓度浓度?)?)标准人标准人IgGIgG不同浓度不同浓度制作标准曲线制作标准曲线待测样品结果待测样品结果142 2、双向免疫扩散、双向免疫扩散(double (double immunodiffusionimmunodiffusion) )： -定性检测定性检测AgAg或或AbAb ； AbAb效价滴定效价滴定AgAgAbAb扩散扩散AgAgAbAb扩散扩散1:21:41:8 1:161:241:641516、免疫电泳、免疫电泳 （immunoimmuno electrophoresis) ele
8、ctrophoresis) + 标本先电泳标本先电泳*两侧挖槽加两侧挖槽加AbAb孵孵 育后出现肉眼可育后出现肉眼可 见沉淀见沉淀-17184 4、火箭电泳：单扩试验、火箭电泳：单扩试验 + + 电泳电泳 可定量分析可定量分析195 5、免疫比浊：、免疫比浊：Ag Ag AbAb Ag-Ag-AbAb（免疫复合物）免疫复合物）比浊仪比浊仪 测量测量 浊度浊度 ， 计算抗原含量计算抗原含量目前替代目前替代 单扩测量血清单扩测量血清IgIg20（四）免疫标记技术四）免疫标记技术用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应：利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶利用荧光素、酶、放射性
9、同位素以及胶 体金标记抗体，以检测相应抗原的技术体金标记抗体，以检测相应抗原的技术1 1、免疫荧光技术、免疫荧光技术（immunofluorescenceimmunofluorescence techniques techniques）n n 利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或细胞内抗原的技术。细胞内抗原的技术。211 1、免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescenceimmunofluorescence techniques techniques）直接法 间接法 2223间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体
10、24n n用酶用酶标记标记AbAb( (或或Ag)Ag)与标本中的与标本中的Ag(Ag(或或AbAb) )发生发生 特异性结合特异性结合n n加入酶的底物，在酶作加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质用下产生有色物质n n根据颜色可作出判断或测量光密度值根据颜色可作出判断或测量光密度值免疫酶标技术：免疫酶标技术：酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 （enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay，ELISAELISA）2 2、免疫酶标技术：、免疫酶标技术：25（1 1）双抗体夹心法：）双抗体夹心法：+26（2 2
11、）间接法）间接法+27283 3、放射免疫测定、放射免疫测定 （radio immunoassayradio immunoassay，RIARIA）：）：n n利用放射性同位素标记技术检测抗利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术原的技术n n灵敏度高，用于检测激素等血清中灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质微量物质294.4.免疫胶体金标记技术免疫胶体金标记技术(immunologic colloidal gold signature(immunologic colloidal gold signature，ICS)ICS) n 胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶胶体金颗粒表面带有较多电荷，用
12、胶 体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标 本中的抗原。本中的抗原。30常用方法：胶体金斑点渗滤试验常用方法：胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验BDCTA31第二节第二节 免疫细胞测定免疫细胞测定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定外周血单个核细胞外周血单个核细胞( (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) )包括淋巴细胞和单核细胞。包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞和多核白细胞密度：为红细胞和多核白细胞密度：为1.0921.092左右，左右，淋巴细胞和单核细胞密度：淋巴细胞和单
13、核细胞密度：1.0751.0751.0901.090，血小板密度：血小板密度：1.0301.0301.0351.035。聚蔗糖泛影葡胺聚蔗糖泛影葡胺(Ficoll):1.0770.001(Ficoll):1.0770.00132一、免疫细胞的分离：一、免疫细胞的分离：（一）外周血单个核细（一）外周血单个核细 胞（胞（PBMCPBMC）的分离：的分离：方法：密度梯度离心法方法：密度梯度离心法分离液：聚蔗糖泛影葡分离液：聚蔗糖泛影葡 胺胺 （比重：（比重：1.077 1.077 0.0010.001）稀释稀释 全血全血分离液分离液RBC RBC粒粒细胞细胞PBMCPBMC稀释稀释 血浆血浆33（二
14、）（二）T T、B B细胞的纯化：细胞的纯化：贴壁法贴壁法去除单核细胞去除单核细胞花环沉降法、尼龙毛法花环沉降法、尼龙毛法分离分离T T、B B细胞细胞（三）免疫磁珠分离法：（三）免疫磁珠分离法：（四）（四）FACSFACS分离法：分离法：34二、二、T T细胞数量检测：细胞数量检测：1 1、E E花环试验：花环试验：n n原理：原理：T T细胞均有细胞均有CD2CD2分子，而分子，而B B细胞无细胞无; ;n n将将SRBCSRBC与人外周血淋巴细胞混合与人外周血淋巴细胞混合; ; n nSRBCSRBC可可结合于结合于T T细胞周围形成花环细胞。细胞周围形成花环细胞。352 2、免疫荧光标
15、记技术：、免疫荧光标记技术：n n用荧光素标记用荧光素标记CD3CD3、CD4CD4或或CD8CD8单抗与淋单抗与淋巴细胞混合巴细胞混合n n经荧光显微镜观察经荧光显微镜观察n n或用流式细胞仪测定或用流式细胞仪测定363738三、三、NK NK 细胞杀伤功能检测：细胞杀伤功能检测：-NK-NK细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体外细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体外 与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞n n取外周血淋巴细胞（含取外周血淋巴细胞（含NKNK细胞）细胞）n n与与K562K562（白血病细胞株）混合，孵育白血病细胞株）混合，孵育4h4hn n通过形态学或细胞计数方法检测通过形态学或细胞计数方法检测K562K562肿瘤细胞肿瘤细胞 被杀伤的数量被杀伤的数量n n计算计算NKNK细胞的杀伤活性细胞的杀伤活性39四、白细胞功能测定四、白细胞功能测定（一）、一）、T T 细胞功能测定细胞功能测定、细胞增殖试验、细胞增殖试验T T细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖
