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1、免疫分析技术之ELISA,广东省功能蛋白质组学重点实验室王 娟,免疫学检测技术,细胞水平,分子水平,基因水平,体外（或体内）测定各类细胞及其亚群的数量和效应，从而了解机体的细胞免疫水平,测定各类免疫球蛋白、补体、细胞因子及其受体、黏附分子的表达水平和生物活性，从而了解机体免疫因子间的相互关系,测定免疫应答相关基因的表达与调控、免疫分子的遗传多态性及基因型别分析,ELISA 概念,酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）， 是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术，基础是：
2、抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,酶免疫测定类型,这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定，简称ELISA。,1.1抗原抗体反应,1.1.1可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb ，AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的
3、结构和活性。,1.1.2特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,1.1.3敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,1.2免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。,基
4、本原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。,2ELIS
5、A的类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。,2.1双抗体夹心法测抗原,A. 将抗体吸附于固相表面；B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物； C. 加酶标抗体；D. 加底物。底物的降解量抗原量。,此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,2.2 双抗原夹心法测抗
6、体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,2.3 间接法测抗体,传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。,A. 将抗原吸附于固相载体表面；B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体；D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量,2.4 竞争法测抗体,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。,2.5 竞争法测抗原,小分
7、子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,2.6 捕获包被法测抗体,IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。,2.7 ABS-ELISA法,：固相支持物；：样品；：特异性IgG；：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；：辣根过氧化物酶HRP
8、-酶标链亲和素（Avidin）；：DAB显色液；：显色；,3. ELISA的试剂(A、B、C三部分),ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,ELISA的试剂准备A,固相载体 聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯，聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔
9、底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。,3.1.2 包被的方式,将抗原或抗体固定的过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，
10、已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。,天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。,3.1.3 包被用抗原,3.1.4 包被用抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须除去杂抗体
11、后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。,3.1.5 包被的条件,pH 9.6碳酸盐缓冲液 pH 7.2的磷酸盐缓冲液 pH 7-8的Tris-HCL缓冲液 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6 封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋
12、白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？,ELISA的试剂准备B,3.2 结合物,即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2 抗体（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4 结合物尚要有良好的稳定性,3.2.1 结合物用的抗原和抗体,制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行
13、反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,3.2.2酶,纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根过氧化物酶HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。,酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种
14、双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合。简便有效.,3.2.3 结合物的制备,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，
15、并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。,酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。,3.2.4 结合物的保存,用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8保存期可达6个月。,3.2.5 结合物的稀释,试剂准备 C 酶的底物,3.3 酶的底物,3.3.1 H
16、RP的底物,OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。,TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。,AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,
