脓汁和粪便标本中病原菌的检测-1

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1、医学微生物学实验医学微生物学实验v医学微生物学实验课是一门操作技能 很强的课程。v实验课教学的主要目标是使学生了解 医学微生物学主要的研究方法和手段 ，掌握基本技能和基本原理，树立牢 固的无菌观念。v更重要的是培养学生自学能力、科学 思维能力、动手能力和表达能力。 微生物学实验室规则v进入实验室必须穿白大衣、戴帽子。v书本、文具放在抽屉里。v实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也 不要用手抚摸头脸等部位。v凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌 处理，不得随便乱放或用水冲洗。v一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。v离开实验室前，必须洗手。怀疑污染应及

2、时用1新洁而灭泡 手。v每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖把拖地以 后再扫地，实验室用紫外线灯照射1小时。实验分组v俩俩相对4人为一组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为 甲、乙、丙、丁。甲 乙4 丙 丁甲 乙3 丙 丁甲 乙2 丙 丁甲 乙1 丙 丁甲 乙5 丙 丁甲 乙8 丙 丁甲 乙7 丙 丁甲 乙6 丙 丁甲 乙10 丙 丁甲 乙9 丙 丁讲台实验室器材 整齐有序常用器材摆放顺序： 电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材： 按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺序，分别 放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。器材使用以后，必须放回原处，依次

3、摆整齐。普通冰箱(3颗星*)冷藏室(上柜）： 温度48，保存培养基、细菌培 养物、常用菌种和抗菌素纸片等。冷冻室（下柜）： 温度18，保存诊断血清、血浆 ，长期保藏的菌种和抗菌素纸片。 卫生工具： 扫帚，拖把，撮 箕，垃圾筐，放 置在冰箱和水池 之间。隔水式电热恒温培养箱：3537， 一般细菌培养时间为1824小时。 奥林巴斯 CX21型 生物显微镜 （实验柜内，每人一台）注意：只能横放，不得竖放。1500W电炉安全警告 培养基沸腾溢出流入电炉 ： 触电危及生命！ 短路断电，。蒸馏水：配制培养基。 1新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手35分钟。 消毒液：擦拭实验台台面。 玻片缸：浸泡用过的载玻片。

4、医学微生物学实验 综合性实验一 v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（P2）培养基的制备P2消毒与灭菌P5细菌的人工培养无菌技术（录像）摆斜面，倾注平板。常见病原性球菌的检查程序P47：直接涂片、革兰染色、镜检 脓汁、痰、咽部分泌物 观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板培养 涂片染色镜检挑取可疑菌落 生化反 应 纯培养 动物实 验药敏实 验 血液、穿刺液 肉汤增菌培养 培养液涂片染色境检 常见肠道致病菌的检查程序P48：粪便 SS琼脂、伊红美蓝平板培养 挑取可疑菌落 血清学鉴定 血、骨髓 增菌培养 双糖铁培养基 染色镜检 生化反应 v从培养基的制备，细菌的分离、纯化、形态学 检查，到细菌的生化试验、

5、血清学试验和药敏试 验，全都由同学们亲自动手操作和完成。v综合性实验是一个连续的过程，一个步骤，一 个环节的失误，将直接影响到最终实验结果。v实验时应严格按要求操作，实验结果要及时观 察，及时记录，以便撰写实验论文。培养基的制备组组号培养基称量 (g)水量 (ml)煮沸 (次)分装 (ml)备备注（40人份）1营营养琼琼脂11.43004瓶，500ml瓶，平板24营营养琼琼脂2.9753515支，中试试管，斜面57营营养肉汤汤1.1501315支，小试试管，液体810半固体1.5503315支，小试试管，高层层公共培基，勿作标记！1500W电炉安全警告 培养基沸腾溢出流入电炉： 触电危及生命！

6、 短路断电。分装包装量筒锥形瓶砝码干粉培养基试管筐天平边台柜子内器材锥形瓶用后洗净、包扎。 器材用后放回原处，依次摆整齐。边台抽屉内器材： 试管（棉塞），刻度吸管，洗耳 球，称量纸，药勺，硫酸纸、牛 皮纸、橡皮筋,尺子。药勺、吸管用后洗净、甩干，放 回原处。称量纸置于左盘，游码 移至标尺左端“0”点位置 上，指针应对准中线，取得 平衡。否则将杠杆两端的调 整螺母旋动调节平衡。秤物时“左物右码”，物 品在左盘上，砝码在右盘， 尽可能放在秤盘中心。天平 保持干燥、清洁。培养基制备v培养基制备程序：干粉培养基蒸馏水加热溶化分 装集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸， 牛皮纸，用橡皮筋扎好 放入讲台边的高

7、 压灭菌桶或高压灭菌筐内送到高压灭菌室 （洗刷室）。v请在 30分钟内完成。培养基培养基是用人工的方法，将多种营养物质，根据 各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。 它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水， pH7.47.6。v培养基制备的一般程序：调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存 。 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌 检定 保存。v培养基的制备原则：(1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必 须灭菌。v培养基的种类（按物理性状分类）液体培养基:不含凝固剂（琼脂），用于增菌，纯培养,保种 。固体培养基:含12琼脂，用于分离培养,纯培养,保种 。半固体培基:含0.30

8、.5琼脂，用于动力检测,保种。液体培养基液体培养基 固体斜面培养基固体斜面培养基 半固体高层培养基半固体高层培养基v培养基的种类（按用途分类）P3基础培养基:含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分 ，可作为一些特殊培养基的基础成分，如普通平板。营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特 殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的 细菌生长，如血平板。增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的 标本，如葡萄糖肉汤。选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有 助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。鉴别培养基：利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在 培养基中加入特定的作用底物和指

9、示剂，用来试验细菌 的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。厌氧培养基：氧化还原电势低，表面用凡士林、石蜡封 住，与空气隔绝，成为无氧环境，如庖肉培养基。培养基的灭菌在冷空气完全排尽的情况下，蒸汽压 103.43 kPa ,温度可达到121.3 ,维持15- 30分钟，可以杀灭包括细菌芽胞在内的所有 微生物。v基础培养基：121高压蒸汽灭菌1530分钟 。v含糖培养基：115灭菌15分钟。v鸡蛋、牛奶培养基:75100间歇灭菌3次(1 天1次)。v不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌（EK 型蔡氏滤器、 G5或G6玻璃滤器、0.45um或 0.22um微孔滤膜）培养基灭菌以后，冷却5060（温度越高，

10、冷凝水越多，越 易污染 ），以无菌操作，倾注平皿10ml（直径7厘米平皿），琼脂 凝固后形成琼脂平板。平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？ 防止平板水分蒸发丢失。 防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。 培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过试管长 度的2/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和 菌种保藏。怎样检查培养基是否合格?无菌试验：将待检培养基置于35培养箱 培养24小时，无任何细菌生长为合格。效果试验：将已知的标准参考菌株，接种 于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况

11、和生化反应是否与预期的结果相符合。卧式圆 形压力 蒸汽灭 菌器YXQ.WY21Dv灭菌器主要由灭菌室、管道系统、电器系统和 蒸汽发生器构成。v蒸汽发生器电压380伏，功率12千瓦。灭菌室结 构采用双层单门不锈钢制造，两层之间为夹层 。v锅炉的蒸汽通过管道直接进入夹层，储存高温 饱和蒸汽，预热灭菌室。经电磁阀控制进入灭 菌室。v灭菌室的冷空气通过冷凝阀以冷凝水的形式排 出。灭菌器的设置 v安全阀：当蒸汽压力超过最高允许使用压力时 能自动跳起，释放超压蒸汽，确保安全使用。v压力表：灭菌室和蒸汽套层各装有压力表一只 ，能指示各层内的蒸汽工作压力。v温度表：能随时显示灭菌室内最低灭菌温度， 有利操作。

12、v冷凝水泄出器：能将灭菌室内的冷空气和冷凝 水在灭菌过程中予以排出，确保灭菌效果。v安全联锁装置：灭菌室压力降到零，蜂鸣器声 响，提示可以安全开门。高压蒸汽灭菌器的操作程序v冷空气的排除：灭菌室压力升至0.07MPa时， 关进汽阀，开排汽阀，使压力降到零 ，排汽 一次。然后关排汽阀，开进汽阀，重复以上 操作。如此反复三次，方可排净冷空气。冷 空气的排除是灭菌成功和失败的关键。v物品的灭菌：一般维持1530分钟。v排除蒸汽。v灭菌物品的干燥（根据需要）。热蒸汽比 冷空气大概 轻一倍，浮 在上层，把 冷空气挤压 到底部，经 排气管道排 出。高压蒸汽灭菌器冷气出口蒸汽入口热气流冷气流常用蒸汽压力与相

13、应温度v压力(磅/吋） 压力（Kpa） 相对温度()8 55.16 112.6 10 68.95 115.215 103.43 121.315 103.43 121.320 137.90 126.21标准大气压=76厘米汞柱高=1.013105帕斯卡 =14.696磅/英寸2。 采用2000个大气压也不能杀死细菌，真正起杀菌作用 是高温。灭菌所需时间、压力与温度指标灭菌物品类 灭菌时间(分) 蒸汽压力Mpa 相对温度 v含糖培养基： 15 0.07 115v基础培养基： 1530 0.11 121v橡 胶 类 15 0.11 121v敷 料 类 3045 0.110.14 121 126v器

14、皿 类 15 0.110.14 121 126v器 械 类 10 0.110.14 121 126v瓶装溶液类 2040 0.110.14 121 126细菌生长繁殖的方式和速度v细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。v繁殖速度：多数2030分钟繁殖1代，结核杆菌 1820小时繁殖一代。v细菌生长繁殖曲线细菌的生长曲线细菌数目的对数培养时间 （小时）5 10 15 20 25 30 6.06.57.07.58.08.59.0活菌数总菌数迟缓期对数生长期稳定期衰退期细菌生长曲线意义v迟缓期：一般14h，细菌代谢活跃，但不繁殖 。v对数期：维持4 8h，细菌快速繁殖，数目呈 几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性 最典型、对抗生素最敏感。细菌鉴定选用此期 为佳。v稳定期： 通常维持10h，活菌数和死菌数几乎 相等，代谢产物形成较多。v衰亡期：培养18 24 h以后，代谢逐渐停滞, 死菌数超过活菌数。常用玻璃器材的处理程序（示教）v新购置的玻璃器材：12盐酸浸泡过夜 中和游离碱 流水冲洗15次晾干包装灭 菌 。