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1、全血胆碱酯酶活性的分光光度 测定方法-羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996一、原理 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸 。 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性 羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化 铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络 合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比 。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆 碱的量计算胆碱酯酶活性。二、仪器 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温0.5； 采血针头； 血色素吸管。三、试剂 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(12) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/
2、L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO412H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl36H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70mol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7mol/mL乙酰胆碱四、采样、运输和保存 用血色素吸管，取耳垂血20L，注入比色 管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立 即
3、进行测定。 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入 玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。 于保温瓶中加冰运送，置于4冰箱中可保 存一周。五、分析步骤六、计算1、按式(1)计算酶活性的绝对值：被水解乙酰胆碱 吸光度=B-A。 以被水解乙酰胆碱吸光度查标准曲线得被水解乙 酰胆碱的量，此值为0.02ml血3730分钟反应条 件下胆碱酯酶活性绝对值= Xs/0.02 式中：Xs水解乙酰胆碱的浓度， mol(0.02mL3730min)； A以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管 的吸光度值； B以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管 的吸光度值。 按式(2)计算酶活性的相对值：Y= X
4、s/ Xc 式中：Y酶活性的相对值，%； Xs被测血样中酶活性的绝对值， mol(0.02mL3730min)； Xc正常人血中酶活性绝对值， mol(0.02mL3730min)。 Xc=1.60mol(0.02mL3730min)2、标准曲线法 被水解乙酰胆碱的吸光度C-(A-B)。 被水解乙酰胆碱的吸光度查乙酰胆碱标准 曲线，得相应的被水解乙酰胆碱(mol)。此 值是0.02mL血液在3730min反应条件下，胆碱酯酶的活性绝对值。 正常健康人全血胆碱酯酶活性可低至正常 的80% 轻度有机磷农药中毒为正常的50% 70% 中度中毒为30%50% 重度中毒多在30%以下 慢性有机磷农药中毒
5、全血胆碱酯酶活性在 50%以下 酶活性下降与症状轻重并不一致，有时酶 活性严重抑制但症状却很轻微。 注意事项 本法检测限为2.4mol/L，线性范围为2.4 1000.0mol/L。 使用的玻璃器皿洗净后，在13硝酸中浸泡 24h，用水冲洗干净后，再用蒸馏水洗三次， 干燥后备用。 取血时不应过度挤压耳垂，如果采血时过度挤 压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例 过多，会使结果偏低。 加碱性羟胺和盐酸(12)时，必须严格掌握振 摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪 色，必须控制在20min内比色完毕。若大批 样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液， 否则会有较大误差。 滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸 光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。 氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需 做标准管。标准管读数在同一比色计上应 保持恒定或仅有较小的变动。 计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区 正常人全血胆碱酯酶活性为基准。
