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1、问题一 下面的图片是在哪种显微镜下观察到的结果问题三：如果想知道某一中蛋白质在细胞中的 分布和不同组织中表达量的差异，如何设计实 验？问题二：细胞系培养过程中一般包括哪些环节 ？第二章 细胞生物学的研究方法第一节 显微镜技术第二节 细胞的培养第三节 细胞的分离和细胞组分的分离第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术第五节 细胞功能基因组学研究技术第六节 生物大分子的结构测定第三节 细胞的分离和细胞组分的分离一 细胞的分离1 利用物理和生物学特性可简单有效地分离 和筛选细胞利用细胞的生长特性分离利用细胞的密度特性分离一 细胞的分离2 免疫磁珠法可获得高纯度细胞免疫磁珠3 流式细胞术精确分选荧光标记的
2、细胞流式细胞仪 4 激光捕获显微切割技术可从组织切片中精确分离 单一细胞 不能分离活细胞 ，精确分离单一细胞7从血液、体液中分离细胞血细胞白细胞血小板红细胞粒细胞单个核细胞 淋巴细胞单核细胞 B淋巴细胞T淋巴细胞 （CD8+和CD4+）8从血液中分离细胞采血方法： 人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血； 小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。 兔 耳静脉或动脉穿刺取血。 9细胞分离技术-从血液中分离细胞血样中红细胞和白细胞的分离：利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。将抗凝血与3%明胶（经灭菌消毒
3、）等量或3l量混合于离心管中，直立静置30-60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。10细胞分离技术-从血液中分离细胞血中单个核细胞的分离：单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。淋巴细胞分离液12细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞血中单核细胞的分离：利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离单 个 核 细 胞 悬 液多将悬液放入12cm直径的培养皿中，于37培养箱中静置30-60min。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋巴细胞）。 用
4、Hanks液强力冲洗吹打与震荡，将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮，收集贴壁的单核细胞。 计数后分别制备所需浓度的细胞悬液。13细胞分离技术-从血液中分离细胞免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞：磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 磁性氧化物核心（Fe3O4）聚合物层（聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分子材料）15细胞分离技术-从血液中分离细胞免疫磁性微珠
5、用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。17细胞分离技术-从血液中分离细胞免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）) 、多种肿瘤细胞等。T淋巴细胞已致敏
6、抗体的免疫磁珠荧光抗体19细胞分离技术-从血液中分离细胞20细胞分离技术-从血液中分离细胞21细胞分离技术-从血液中分离细胞22细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞MACS技术优点： 稳定、高质量的分选：纯度（90-99%） 对细胞无损伤 操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内 完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。 从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个 细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。 分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞 培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞 组分均可回收利用。 从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还
7、可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA 、RNA及mRNA。MACS技术缺点：l分离效率较流式细胞仪分选略低l且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。l只适用于简单标记的细胞分离23细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞： 用RPMI-1640培养基调整单个核细胞成1107 /ml悬液； 加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4孵育30min, 用RPMI-1640培养基洗2次； 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。24细胞分离技术-从血液、体液中分离
8、细胞流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：从血液、体液中分离细胞血细胞白细胞血小板红细胞粒细胞单个核细胞 淋巴细胞单核细胞 B淋巴细胞T淋巴细胞 （CD8+和CD4+）制备细胞匀浆细胞匀浆液膜膜细胞器细胞器 大分子大分子 方法：低渗透压低渗透压 超声振荡超声振荡 在细胞膜上打孔在细胞膜上打孔 强制通过微孔强制通过微孔 机械破碎或研磨机械破碎或研磨二 细胞组分的分离和纯化二 细胞器及细胞组分的分级分离1 差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒2 速度沉降分离沉降系数不同的颗粒3 平衡沉降分离密度不同的颗粒密度梯度 离心密度梯度离心 密度梯度离心（density gradient centrifuga
9、tion）：将待分离的细胞组分铺放在不连续介质表面或内部，离心使细胞不 同组分以不同速率沉降，形成不同沉降带。 类型：速度沉降速度沉降；平衡沉降平衡沉降。 常用介质：蔗糖、多聚蔗糖、甘油、氯化铯 。密度+2 速度沉降（velocity sedimentation） 用途：分离密度相近而大小不等分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 原理：制备梯度离心介质（密度由顶部到底部逐 渐增加）,分离物按各自的沉降系数以不同的速度 沉降，形成不同的沉降带而达到分离。 梯度特点:梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，介质 的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 分离效率: 取决于沉降系数间的差异。速度沉降
10、速度沉降平衡沉降平衡沉降3 平衡沉降（equilibrium sedimentation） 用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。 特点：（1）介质密度较高，陡度大(20%-70%） ，介质的最低密介质的最低密度应大于被分离组分的最大密度。度应大于被分离组分的最大密度。（2）所需的力场通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。 原理原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离 心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留停留在那里达到 平衡，从而将不同密度的成分分离。 分离效率: 取决于浮力密度间的差异速度沉降速度沉降平衡沉降平衡沉降速度沉降：大小和形状平衡沉降：浮力密度C
11、sCl平衡沉降证实DNA半保留复制（1957 ， Meselson，Stahl ）15N/15N-DNA15NH4Cl溶液14NH4Cl溶液15N/14N-DNA14N/14N-DNA15N/14N-DNA三 蛋白质的分离与鉴定1 层析的方法纯化蛋白质2 电泳的方法分析、鉴定蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-分子量的不同等电聚焦电泳-等电点的不同双向电泳-分子量和等电点的不同离子交换层析-电荷的不同凝胶过滤层析-分子大小的不同亲和层析-形状离子交换层析：是 一种根据被分离物 质的分子表面电荷 性质来分离的吸附 层析。将具有特殊结构的亲和分子制成 固相吸附剂放置在层析柱中，当 要被分离的蛋白混合液
12、通过层析 柱时，与吸附剂具有亲和能力的 蛋白质就会被吸附而滞留在层析 柱中。那些没有亲和力的蛋白质 由于不被吸附，直接流出，从而 与被分离的蛋白质分开，然后选 用适当的洗脱液， 改变结合条件 将被结合的蛋白质洗脱下来，这 种分离纯化蛋白质的方法称为亲 和层析。 SDS聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳技术术首先在1967年 由Shapir0建立，其原理：聚丙烯酰烯酰 胺凝胶是由 丙烯酰烯酰 胺(简简称Acr)和交联剂联剂 N，N一亚亚甲基双 丙烯酰烯酰 胺(简简称Bis)在催化剂剂过过硫酸铵铵(APS)，N ，N，N，N 四甲基乙二胺(TEMED)作用下， 聚合交联联形成的具有网状立体结结构的凝胶，并
13、 以此为为支持物进进行电电泳。等电聚焦电泳(IFE ）利用聚丙烯酰胺 凝胶内的缓冲液在 电场作用下沿电场 方向在凝胶内制造 一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。凝胶中加 有两性电 解质溶液 （pH9-3 ）加电场后 在凝胶内形 成一个稳定 pH梯度加样品 ，然后继 续电泳凝胶染色表明 样品按照各自 pI值沿着pH梯度分布等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后（）（）（ ）（）高pH高pH低pH低pHC 双向电泳第一向第一向：等电聚焦电泳 第二向第二向：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶经染 色后蛋白呈现二维分布 图：水平方向反映
14、出蛋白 在pI上的差异，垂直方 向反映出它们在分子量 上的差别。第一向电 泳：等电 聚焦电泳聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳第二向电泳 ：SDS- PAGE分子量大分子 量小pH9pH3pH9pH3四 核酸的分离纯化与鉴定1 差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法2 凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法细胞化学技术（Cytochemistry）：在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞和细胞内的细胞器的结构、功能关系的一种技术。第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术一、酶细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、放射自显影技术四、细
15、胞示踪技术与应用（GFP）一、酶细胞化学技术通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在 细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。二、免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的 特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相 应抗原的方法。常用的标记方法：1)荧光标记：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明2)酶标记：辣根过氧化物酶（HRP）3)铁蛋白标记：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜下铁离子可显黑色4)胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它与抗体标记后，经抗原抗体反应可定位抗原的存在。免疫铁蛋白电镜技术免疫铁蛋白电镜技术免疫胶体金电镜技
16、术免疫胶体金电镜技术免疫荧光显微镜技术免疫荧光显微镜技术 （Immunofluorescence microscopyImmunofluorescence microscopy）荧光素标记抗体的方法：直接法：荧光素直接和第一抗体相偶联优点：简单方便，易于操作，省时省力缺点：敏感度不够，特异性不强，标记抗体需自己制备间接法：荧光素先和第二抗体（抗第一抗体的抗体）偶联，再 与第一抗体作用优点：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗缺点：操作比直接法复杂三、放射自显影术(autoradiography)放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感 光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉 冲标记活细胞,经固定、切片后在暗处把感光乳胶 覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使 乳胶曝光(卤化银还原成银离子),经显影、定影,根 据银粒所在部位,就可知道细胞中放射性物质的分 布。将放射性化合物渗入活细胞固定
