柱层析、固相萃取和制备色谱

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1、柱层析、固相萃取和制备色谱柱层析、固相萃取和制备色谱分析过程中各步骤花费的时间分析过程中各步骤花费的时间样品前处理 61% 采样6% 分析6% 数据处理27%分离与富集分离与富集分离（separation）的概念 分离是一种假设状态，在这种状态下，不同的物质被 分开了（isolation）。 含有m种化学组分的混合物被分成m个常量范围。 把m种化学组分分成m种纯的形式，并把它们置于m个独 立的容器中。 利用混合物中各组分在物理或化学性质上的差异，通 过适当的装置或方法，使各组分分配至不同的空间区 域或者在不同的时间依次分配至同一空间区域的过程 。富集（concentration）的概念： 在分

2、离的过程中使对象物质在某空间区域的浓度增加 。 从大量基体物质中将欲测量的组分集中到一较小体积 的溶液中，从而提高检测灵敏度。分离与富集的关系： 富集需要借助分离的手段，在分析过程中分离与富集 往往是同时实现的。 富集与分离的目不同，富集只是分离的目的之一。柱层析法（柱色谱）柱层析法（柱色谱） 柱色谱概述 常用柱色谱介质的分类 柱色谱操作流程柱色谱柱色谱-概述概述吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各 组分的吸附力不同而使各组分分离。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附解吸 再吸附再解吸的过程，吸附力较强的组分， 移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分， 移动的距离大，先出柱。 常用柱色谱介质的分类常

3、用柱色谱介质的分类无机物色谱介质氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型 和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物色谱介质琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等。 柱色谱柱色谱-吸附剂氧化铝吸附剂氧化铝市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度 规格大多为100150目。 碱性氧化铝（pH9-10） ：适用于碱性物质（如胺、生物 碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃 类、甾体化合物等中性物质的分离。 酸性氧化铝（pH3.5-4.5）：适用于酸性物质如有机酸、 氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。 中性氧化铝（pH7-7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基 化合物以及在碱性

4、介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分 离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。层析用硅胶为一多 孔性物质，分子中 具有硅氧烷的交链 结构，同时在颗粒 表面又有很多硅醇 基。非极性和极性化合物，适 用于芳香油、萜类、甾体 、生物碱、强心甙、蒽醌 类、酸性、酚性化合物、 磷脂类、脂肪酸、氨基酸 ，以及一系列合成产品如 有机金属化合物等 吸附剂硅胶柱色谱柱色谱-吸附剂硅胶吸附剂硅胶柱色谱操作流程柱色谱操作流程装柱装柱硅胶浸泡于石油醚中，搅拌均匀后一次性倒入柱中预先加入溶剂敲打均匀紧密柱色谱操作流程柱色谱操作流程装柱装柱柱色谱操作流程柱色谱操作流程拌样拌样 样品10mg溶于溶剂中，全溶 加拌样硅胶10015

5、0目1:1-1.5 搅拌均匀至干 必要时旋蒸至干柱色谱操作流程柱色谱操作流程-拌样拌样溶解 搅拌 至干柱色谱操作流程柱色谱操作流程-上样上样 均匀加到柱中柱色谱操作流程柱色谱操作流程-洗脱与接收洗脱与接收 用不同比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯 度洗脱 每个极性洗脱35个保留体积 每个保留体积接收1020份馏分 整个过程加低压柱色谱操作流程柱色谱操作流程-浓缩浓缩浓缩方法 溶剂浓缩 自然挥干 减压浓缩 冻干柱色谱操作流程柱色谱操作流程-薄层鉴定薄层鉴定 吸附剂：硅胶CMC 展开剂：C6H6EtoAc(3:2或97：9) 显色剂：（1）氨蒸气熏。（2）5%KOH 喷雾制备色谱制备色谱 第一部分.制备

6、HPLC概述 第二部分.制备HPLC技术问题u上样 u条件的选择 u循环色谱 u柱切换制备HPLC概述 制备色谱到底是什么？结构与分析型一样，但泵流量大、进样 量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备HPLC概述 制备HPLC与分析HPLC比较目的 填料流量流通池 联系 制备HPLC样品中特定 成分的高纯 度获取，大 量、廉价的 制备 20m以 上为佳 0.1-150ml/min 最大允许流 速可为 150mL/min在进行制 备HPLC 之前，常 先进行分 析HPLC 实验，对 分析方法 进行优化 、放大应 用到制备 HPLC中 ，详见后 。 分析HPLC 定性分析： 检测的灵敏 度 定量分

7、析： 分离度、再 现性 3-5m 0.001-9.999ml/min一般的分析 池的最大允 许流速仅为 5 mL/min， 或者 10mL/min制备HPLC概述主要结构单元输液部:输液泵分离部:制备柱检测部:检测器馏分部:馏分收集器制备HPLC概述对仪器的要求l 制备泵的耐压制备HPLC系统因制备柱的填料很细，分离度好，同 时反压很高，整个系统对压力很敏感，制备泵要求能 在制定的恒流量下, 克服100 - 150 bars反压l 色谱柱的柱容量（柱负荷）不影响收集物纯度时的最大进样量；一般都超载进 样。但进样量超过柱容量，柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k

8、降 低10%为宜。制备HPLC概述分离效能取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个 分离参数进行优化常会影响到其他分离参数。分辨率速度载样量增加洗脱液流速会降 低分辨率，分辨率也 会因上样量过大而下 降。但分辨能力并不 总是制备HPLC首要 考虑的因素，制备型 HPLC应首先具有经 济、快速的生产所需 产品的能力。 在许多分离工作中，需要从大量的物质中 分离纯化不足的所需成分，这种分离 工作十分困难，在纯化的最后阶段常需使 用m或更小颗粒的高效填料。为获 得所需微量组分，可采用如下手段： 制备型分离-半制备型分离-分析型分离- 产物。制备HPLC概述分离效能制备HPLC有关技术问题超量进样大样

9、品量的 纯化方法分析系统的放大: 使用直径更大的制备柱、 更高的流速，根据色谱柱的长度增加进样量 并保持样品浓度不变，峰形尖锐而对称。需 大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样 品，不经济色谱柱超量载样：相同的条件下超量进样浓缩法和 体积超载法制备HPLC的首要 问题是快速、 高效的制备色 谱纯的产品！ ！分离度不是首要问题， 色谱峰会比较难看！制备HPLC技术问题组分的收集制备HPLC技术问题样品的初步纯化 在利用制备HPLC最终纯化步骤前做一些初步纯化是提 高效率降低成本的优化措施.比如最终纯化通常有一定的分离难度,又希望有足够的 收率,所以使用的仪器和填料可能是昂贵的.未经预纯 化的样品

10、,尤其是天然产物,含有大量的可能在填料表 面不可逆吸附的组分,直接进样,可导致昂贵的填料很 快失效. 此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了 进样量和生产效率. 同时分别用正反相色谱去除前后 杂,比单用一种色谱得到目标产物更简单易行. 总之,制备色谱尤其是工业色谱的目标不仅是找到技术 上可行的方法,而且要综合考虑成本.上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度和 制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是 否还用分析用填料）根据内径计算：内径放大N倍，进样量大致 可放大N平方倍（柱长一定时）制备HPLC技术问题上样量的选择将分析色谱上的结果放大到制备色谱中：上样量的调整： mp/ma=lp/l

11、a * r2p/r2aL:柱长；m：进样量；r：色谱柱内径 p: 制备柱；a：分析柱制备HPLC技术问题条件的选择从分析方法到制备方法的放大和方法的 优化需要三个步骤：1. 优化分析方法的选择性。2. 在分析柱上进行超量载样。3. 放大到制备柱。线性放大非线性放大制备HPLC技术问题条件的选择 线性放大指柱直径、长度（即柱体积）和流速等可以根据加样 量的增加情况进行按比例线形放大。制备色谱中，最 好的线形放大是在其他工艺条件不变的情况下，只改 变柱子和流速，就可以放大生产，同时分离效果保持 不变。成本比较大，同时也大大减少生产的产量和速 度 非线性放大制备HPLC技术问题条件的选择l流速的调整

12、 l梯度洗脱分离效果取决于梯度的选择，理论上梯度越小，分辨率越高。在 分析上摸好条件，上制备柱往往还要降低一些洗脱液的浓度。l柱子再生依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5 -10个柱体积。制备HPLC技术问题条件的选择 1）制备的目的是在一次操作中尽可能地多上 样，所以，首先得在分析柱上实现超载，否则 ，分析柱分离得再漂亮，再在制备柱中线性放 大时就因为成本不合理而被无情地否决。 2）制备的目的是分离你所关心的组分，只要 它能与其它杂质分离的好就行了，所以不要希 望在分析柱上先得到所有组分的基线分离，完 全没有必要！设计梯度时只需对目的物前后5- 10%梯度的范围进行精细

13、分离。制备HPLC技术问题条件的选择 3）制备中常常因为超载而无法使目的物与邻 近杂质间达到基线分离，可以采用分段收集的 方法得到指定纯度的目的物，要求越纯，单次 操作的得率也越低。 4）制备中因为目的物来之不易，常常需要将 纯度不合格得目的物重新上柱循环，一般只需 稀释1-2倍就可以了。由于重新上柱是会增加 成本的，所以超载的量要平衡单次操作的纯品 得量和效益与返工成本，以单位纯品数量进行 成本核算，以优化最佳上样量。 固相萃取技术固相萃取技术SPE 一. SPE基本原理 二. SPE法的优点 三. SPE装置 四. SPE柱填料类型 五. SPE分析方法的建立 六. SPE的应用SPE-S

14、PE-基本原理基本原理 定义：利用固相吸附剂将液体样品中的目标化 合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离， 然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目 的。 分离：杂质保留或目标化合物保留。 富集：目标化合物保留，化合物极性与吸附剂 极性越接近，保留越强。 分离机理：利用杂质或目标化合物与样品基体 溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小。SPE-SPE-基本原理基本原理l SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与HPLC有许多相似 之处。 l SPE柱的填料粒径（40m）要比HPLC填料（3 -10m）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE 柱效比HPLC色谱柱低得多。 l SP

15、E只能分开保留性质有很大差别的化合物。 l SPE柱是一次性使用。 SPESPE-优点优点许多分析方法中已经替代了液-液萃取 节省分析时间 减少有机溶剂的使用，不污染环境 高效、快速，可同时处理多个样品 提高分析质量，减少背景的干扰 提高了回收率固相萃取所需 时间为液液 萃取的1/2， 费用为液液 萃取的1/5。SPESPE柱柱最简单的固相萃取装置就是一根直径为数毫米的小柱 由医用聚丙烯管，多孔筛板，填料三部分组成。小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀聚乙烯聚四 氟乙烯等塑料的，还可以是不锈钢制成的。 规格：100mg/1mL，200mg/3mL，300mg/3mL，1g/6mL， 2g/12mL。SPESPE柱的选择柱的选择样品量 萃取柱的大小 1ml1ml 1ml-250ml，且不要求萃取速度3ml1ml-250ml，要求快速萃取6ml10ml-250ml，要求高样品容量12，20或60ml 1L和要求高样品容量 90mm 被萃取样品的质量不超过柱中填料量的5%！ SPESPE柱及其配套装置柱及其配套装置自然淋洗自然淋洗-简易支架简易支架 加正压加正压 -注射器注射器 加负压加负压 -真空装置真空装置SPESPE常见填料常见填料类型类型1.硅胶和键合硅胶2.高分子聚合物3.其他