分子生物学技术分子克隆

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1、研究生科研基本训练常用实验基本技术生物化学与分子生物学系 肖鹏 生物医学研究常用基本技术 分子克隆技术（DNA重组技术） 免疫印迹技术（Western blot） 免疫组织化学技术（免疫组化） 细胞培养技术局限性 联合应用分子克隆技术DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的 需要以人工的方法将感兴趣的目的基因，在体外与载 体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并 筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、 成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。 基本过程 分、切、连、转、筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。 目的基因的来源： 直接分离适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体

2、、质粒及病 毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶 的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电 泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从 胶中回收DNA。(适合原核) 人工合成 序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较 短的）。由mRNA逆转录合成cDNA 细胞总RNA分离 mRNA分离 目的基因mRNA的 纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合 成 cDNA的克隆从基因组文库中筛选目的基因 首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文 库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出 来。载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在

3、 细胞内自主复制的DNA分子。 理想的质粒克隆载体应具有的特性： 能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增 具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点 (MCS, multiple cloning sites)， 便于进行克隆 分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制 易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性 、 -互补显色反应（蓝白斑筛选） 表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列， 增强子等调控元件 生物安全性好 目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。载体2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生 便于连接的末端。 3.连：将切割后的目

4、的基因和载体用T4DNA连接酶连接 。 4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（ 细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细 胞）。 5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需 的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的 宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切 结果，筛选标记等。 RNA的提取和cDNA合成 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 质粒、PCR产物的酶切 重组DNA的连接 重组质粒的转化及筛选 凝胶电泳 测序技术 DNA体外重组技术总RNA制备 Trizol法: 主要用途：总RNA提取 （DNA、蛋白质提

5、取） 主要成分：苯酚、异硫氰酸胍等 适用组织：人类、动物、植物、微生物的组织，细 菌或真菌 样品量：从几十毫克至几克。 用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA 可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分 子克隆。Invitrogen TRIzol产品 RNA提取试剂盒：国产、进口常用总RNA提取试剂盒尽量选用含DNA酶的试剂盒Trizol法提取总RNA步骤以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品 总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 研磨液室温放置5分钟，然后以每1 ml Trizol液

6、加入 0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇 荡离心管15秒，静置3分钟。 取上层水相于一新的离心管，按每1 ml Trizol液加 0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟 ，12000 g离心10分钟。 弃去上清液，按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比 例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下 7500 g 离心5 分钟。 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70。Tips： 样品收集后迅速

7、放入液氮； 样品在Trizol溶液中相对稳定； 注意避免RNase，尤其是内源的；丰度低的mRNA：实验所需的耗材需要0.1%DEPC水处理，高压灭菌丰度中等以上的mRNA：耗材高压灭菌即可。 获得高纯度RNA，要懂得取舍； 上清取适量即可（500 ul）。 完全干燥的RNA溶解度极低；完全干燥的RNA呈透明状；趁RNA沉淀仍然呈白色的时加水溶解 RNA样品相关实验要尽快进行，如需保存RNA，需存于-80 度超低温冰箱；避免RNA酶污染 由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而 降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而 在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并 设法抑制其活性,这是本实验成败

8、的关键。 在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转 录过程中都要避免RNA酶污染。 DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙 酯）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的 活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活 性。 实验用品用0.1%DEPC水处理（2 h），高压 蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无 RNA酶实验用品。 操作过程中带手套、口罩。避免RNA酶污染逆转录反应（cDNA合成） 逆转录（reverse transcription）： 是 指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。逆转录反应体系的基本成分 模板: 组织或培养细胞总RNA。 逆转录酶：AM

9、V: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒 引物: oligo dT, random primer，GSP等。 RNA酶抑制剂 底物：等浓度的四种dNTP 反应环境: 缓冲液（RT buffer）可单独购买或逆转录试剂盒Tips： RNA质量要好；无降解 RNA样品应加热变性处理；RNA 65oC处理5 min，随后迅速置于冰上，打开二级结构这一步不加任何反应组分 反应中RNA模板量要合适；太多？太少？PCR技术 PCR（Polymerase Chain Reaction）即 聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下 ，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起 点，通过变性、

10、退火、延伸等步骤，体外复 制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过 程。一种选择性体外扩增DNA的方法. 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量扩增的 技术。 半保留复制Kary Mullis 1993年 诺贝尔化学奖 三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片 段在94下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引 物在适当温度(50左右)下与模板 上的目的序列通过氢键配对 (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚 合酶合成DNA的最适温度下,以目的 DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理 论上每一轮循环将使目的DNA扩增

11、一倍,这些经合成产生的DNA又可作 为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA扩增达数百倍。PCR反应体系的基本成分 模板: 双链或单链DNA 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 DNA聚合酶: 如Taq酶 （Thermus aquaticus） 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） 反应环境: 含有Mg2+的Tris-Cl缓冲液。含DNA聚合酶的2反应混合物 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子, 可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子 比环状分子的扩增效果稍好). 就模板D

12、NA而言,影响PCR的主要因素是模板 的数量和纯度.PCR反应体系的基本成分 引物： PCR反应产物的特异性由一对上下 游引物所决定。与模板DNA特异互补的单链 寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物PCR反应体系的基本成分浓度: 0.1umolumol/L6 10123 1013Primer 错配率 非特异性产物 引物二聚体 引物设计原则引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。引物中G+C含量通常为40%-60%四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷

13、酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。在引物内, 尤其在3端应不存在二级结构两引物之间尤其在3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。引物5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基引物的选择与设计 从文献中查找 利用引物设计软件获得：如Primer 在线软件 Blast分析NCBI BLAST Nucleotide blast 直接找 Taq DNA聚合酶：Taq polymerase The

14、rmus aquaticus53 DNA 聚合酶活性以及 53 核酸外切酶活性无 35核酸外切酶活性致命弱点：出错率高LA Taq polymerase, PrimeStar DNA polymerase, Pfu DNA polymerase，Fast Pfu DNA polymerase dNTP ：dATP dUTP dCTP dGTP 一般反应中每种dNTP的终浓度为200250 mol/L。4种dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的 错误掺入。PCR反应体系的基本成分 含Mg2+的反应缓冲液：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很 大,它可影响酶的活性和

15、真实性,影响引物退火和解链温度, 影 响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。PCR反应体系的基本成分浓度: 1.5 mmol/L Mg2+ Product 特异性 Mg2+ Product 特异性 Vary Mg2+ in steps of 0.5 mM.PCR体系的建立 25 or 50ls in a micro Eppendorf (0.2ml) tubePCR反应的条件 预变性： 94，5min 变性：94, 30s, 模板DNA变性成为单链 退火：Tm-5, 30s，引物与模板DNA结合 延伸：72，与扩增片段长度有关，1Kb, 延长时间 循环数：25-35，平台期之前。 最终延伸： 72， 10min。3-4 hoursUV visualisationThe final productTips： 反应体系混匀； 正负对照必须有； 反应条件可以尝试梯度，且只改变一个变量； 根据实验需求选择相应品牌的DNA聚合酶Master Mix; 带Loading的M