琼脂糖凝胶电泳

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1、DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测 一、实验原理电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常 用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多 孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将 向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨 架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。 当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就 会增加，不同长度的DNA/RNA片段就会出现 不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子 的大小使其分离。分离长度凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp近50kb 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5500bp 分辨率高采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子。含不同量琼脂糖的凝胶

2、的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量 %（W/V）DNA/RNA分子的分离范围 （ kb ） 0.3560 0.61200.70.8100.90.571.20.46 1.50.2320.12EB染料 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外 灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝 胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA 分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增 强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测 琼脂糖中的DNA。 电泳缓冲液的组成 Tris乙酸（TAE） Tris硼酸（TBE） Tris磷酸（TPE）其浓度约为50mmoL/L，PH为7.57.8,这些缓冲液 均含有EDTA。这些

3、缓冲液通常配制成浓缩液，贮存 于室温。 常用的电泳缓冲液的配制缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris乙 酸（ TAE）1：0.04moL/L Tris 乙酸0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱 57.7mL 冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) Tris磷 酸（ TPE）1：0.09moL/L Tris 磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris碱 15.5mL 85%磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) Tris硼 酸（ TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸 0.001moL/L EDTA5：54

4、g Tris碱 27.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)加样缓冲液 缓冲液类型 6缓冲液贮存温度 I 0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水 溶液4II 0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖水溶液室温III 0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4IV 0.25%溴酚蓝40%（W/V蔗糖水溶 液）4V （碱性加样缓 冲液）300m moL/L NaoH6 mmoL/L EDTA18%聚蔗糖水溶液015%溴甲酚绿025%二甲苯青FF4 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入 样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从

5、而使加样操作 更为便利。 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的 2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖 凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。 DNA片段长度标记 DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker,本实验使用 Gene RulerTM DNA Ladder Mix 为DNA片段长度标 记，分别由100bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1031 bp、 1200 bp、1500 bp、2000 bp、2500 b

6、p、3000 bp、 3500 bp、4000 bp、5000 bp、6000 bp、8000 bp、 10000 bp 组成，DNA Marker不仅可以作为凝胶中 DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。二、实验方法 150TAE的稀释：如 制备50mL 1TAE，取 1mL 50TAE加入49mL 水定容至50mL。 2制备1%的琼脂糖胶 液：取0.2g琼脂糖溶于 20mL TAE中，在短时 间里加热琼脂糖全部熔 化，使溶液冷却至 60.(加入浓度为 10mg/mL的EB 2L， 使EB的终浓度为 1g/mL)。 3用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用 乙醇干燥后

7、灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后 用DEPCSDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。 4用胶带封住胶床，放好梳子。 5将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间， 凝固2060min。 6在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽 内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 7向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面 1cm。 8分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品 加入加样孔。 9正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为 50mA。 10电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。三、注意事项与实验技巧 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 紫外

8、光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护 。 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否 则样品渗漏或DNA带型不整齐。 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很 小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板， 梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等 ；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物 、酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板 制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。 四、跑出好看的电泳图 凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清 澈不清澈 ； 一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看 ； 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压； 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应 ，中间 电场比较均匀 ； 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致； 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内 ； 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。 Thanks农药学