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1、19 两水相萃取法 传统的溶剂萃取法并不适合大分子生物产品： 1、胞内产品需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固液分离带来了困难；2、生物产品对pH值、温度和离子强度等因素敏感，在有机溶剂中的溶解度低并且会变性。因此，基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术，又称水溶液两相分配技术是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。双水相萃取法的优点：1、能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或其碎片时，还可以纯化蛋白质25倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。2、双
2、水相萃取法和传统的酶组分离方法(盐析、有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势。例如：3、处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法，设备需用量要少310倍。 1、已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如甲酸脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。应用概况：2、近年来又进行了双水相萃取小分子生物活性物质；例如：红霉素、头孢菌素C、氨基酸的研究和亲和双水相萃取的研究，大大扩展了应用范畴并提高了选择性，使双水相萃取技术具有更大的潜力和宽阔的前景。3
3、、但双水相萃取技术真正工业化的例子很少，原因是成本较高，使它在技术上的优势被削弱。双水相萃取中，原材料成本占了总成本的85以上并且总成本随生产规模的扩大而增加很多。解决方案：合成价格低廉、具有良好的分配性能的聚合物；加强萃取后的回收利用研究。一、两水相的形成当两种聚合物溶液互相混和时，究竞是否分层或混和成一相，决定于两种因素：1、熵的增加。2、分子间作用力。两种物质混和时，熵的增加与涉及的分子数目有关。因而，如以摩尔计算，则小分子间与大分子间的混合，熵的增加是相同的。但分子间的作用力，可看作分子中各基团间相互作用力之和，分子越大，当然作用力也越大。根据上述讨论可见，对大分子而言，如以摩尔为单位
4、则分子间的作用力与分子间的混合熵相比占主要地位，因而主要由分子间的作用力决定混和的结果。两种聚合物分子间如有斥力存在，则平衡后，就可能分成两相。这种现象称为聚合物的不相容性。如果两种聚合物间存在引力，而且引力很强，如在带相反电荷的两种聚电解质之间，它们相互结合而存在于一共同的相中。如果两种聚合物间不存在较强的斥力或引力，则两者能相互混和。聚合物与盐类溶液也能形成两相，这是由于盐析作用，如PEG与碱性磷酸盐或硫酸盐形成的两相。在生化工程中得到应用的仅限于聚乙二醇葡聚糖和聚乙二醇无机盐系统，这是由于这两种聚合物证明都无毒性，而且它们的多元醇或多糖的结构，能使生物高分子稳定。例如, 点M代表整个系统
5、的组成， 该系统实际上由两相组成，上相和下 相分别由点T和B表示。M、T、B三点 在一直线上，T和B代表成平衡的两相 ，其相连的直线称为系线. 在同一条系 线上的各点分成的两相，具有相同的 组成，但体积比不同。二、相 图对于由P, Q两种聚合物和水组成的系统，当P、Q达到一定浓度时才会形成两相。图中曲线把均匀区域和两相区 域分隔开来, 称为双节线。(19-1)式（191）的证明：当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失，点K称为临界点临界点或褶点褶点。双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分
6、子量相差越大， 双节线的形状越不对称。三、分配理论（一）、表面能的影响和溶剂萃取法一样，蛋白质在两水相间的分配，由 分配系数 KClC 2 来描述、习惯上Cl代表上相中的浓度， C2代表下相中的 浓度。当相系统固定时, K为一常数，与蛋白质的浓度无关.当达到平衡时，分子或颗粒如处在某一相中时，能量较低，则它们比较集中地分配在该相中。设分子自相2移至相1所需的功为E，则根据相平衡时，化学位应相等的原则，不难推得，分配系数K应为：从上式可知，在某一相系统中，分配系数主要决定于分子 的表面积与表面性质。（二）电荷的影响（三）、综合因素表面自由能可用来量度表面的相对憎水性，改变成相聚合物的种类，其平均
7、分子量和分子量 分布以及浓度都对相的憎水性有影响。因为表面 积一般来说都比较大，故的微小改变会引起蛋白质的分配系数有很大变化。加入系统中的盐类，以及pH会影响相间电位差和蛋白质所带电荷数，因而也对分配系数有影 响。如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。实验可很方便地在10 ml有刻度的离心试管中进行。如检定工作跟得上，则在几天内就可求得所需的 萃取条件。但有时液体粘度比较大，用吸管操作时容 易引起误差，需要注意。四、影响分配的参数主要有：聚合物的分子
8、量和浓度、pH、盐的种类和浓度、温度等。适当选择各参数，可达到较高的分配系数和选择性。两水相萃取法的一个重要优点：可直接从细胞破碎匀桨液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，因而在一步操作中可达到固液分离和纯化两个目的。改变pH和电解质浓度可进行反萃取。当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。例如：在PEGDx (Dx 代表葡聚糖Dextran)系统中，PEG的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。此为普遍规律，不论何种成相聚合物系统，或何种进行分配的生物高分子都适用。（一）、聚合物的分子量（二）、聚合物的浓度当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，
9、分配系数接近于1。如成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1，或减小低于1。当远离临界点时，系统的表面张力也增加。如果进行分配的是细胞等固体颗粒，则细胞易集中在界面上，因为处在界面上时使界面面积减小，从而使系统能量减减小，但对溶解的蛋白质来说，这种现象比较少见（三）、盐类的影响各种无机离子在PEG Dx 两相中的分配系数如表192 所示：由于各相应保持电中性，因而在两相间形成电位差，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生根大影响，参见式(1910)。例如：加入NaCl对
10、卵蛋白和溶菌酶分配系数的影响见图194。由此可见，加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。当盐类浓度继续增加时，影响逐渐减弱，分配系数基本上无变化。当盐类浓度很大时，则由于盐析作用，蛋白质易分配于上相，1ogK几乎随NaCl浓度增大，而线性地增大(图195)。各种蛋白质的增大程度有差异，利用此性质，可使蛋白质相互分离。由于HPO42离子在PEG一葡聚糖系统中的分配系数很小，因而加入pH大于7的磷酸盐缓冲液能很方便地改变相间电位差，而使带负电荷的蛋白质移向富聚乙二醇的相。（四）、pH的影响pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因 而改变蛋白质所带电荷和分配系数。根据式(1910
11、)，当系统一定时，分配系数K与 荷电数Z的关系可表示为：(1921)式中与系统的组成、加入的盐类和温度等有关。对一些已知PH与荷电数之间的关系的蛋白质，如溶菌酶 和卵蛋白的研究表明，确实符合于上式。pH影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4- 与HPO42-的比例，会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变23个数量级。研究分配系数与pH的关系时，如加入不同的盐类，则出于电位差不同，这种关系也应不同。但在等电点时，得到的是不带电荷分子的分配系数，对不同的盐类系统，应有相等的值。因而在不同的盐系统中，分配系数与PH的关系曲线的交点即为等电点。这种测定等电点的方
12、法称为交错分配。例如血清清蛋白的交错分配见图196。（五）、温度温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度高时，粘度较低，有利于相的分离操作。（六）、荷电PEG作为成相聚合物在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差。可以在 PEG或聚葡糖上引入带电荷的基团。但从式(1919)来看， 相间电位差与电荷数成反比，而每一葡聚糖分子上可以引入 很多带电荷的基团，故效果较差。相反每一分子PEG只含两 个羟基，只能引入两个荷电基团，故使电场增大的效果较好
13、。几种带正电或负电的PEG衍生物：带正电；三甲胺基 PEG(TMA-PEG)：氨基PEG(PEGNH2)。带负电：PEG-磺 酸盐；羧基一PEG(PEG一COOH).利用荷电PEG能产生较大的相间电位，故能使分配系数 增加。五、成相聚合物的回收聚合物或盐回收利用十分重要。例如：从1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kg PEG1550和533kg K3PO3，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳方法。 如果蛋白质积聚在聚乙二
14、醇中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。另一种力法是通过盐折或使用水溶性的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的选择性相互作用进行的。然而，当粘性聚合物溶液通过柱被处理的时候，会出现高的压力降。除此外，也可以通过电泳或亲和分配和双水相萃取结合的方法来回收或减少PEG的用量。六、应用（一）、工艺方面的问题两水相萃取法主要应用于胞内酶提取。运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：(1)、欲提取的酶和细胞应分配
15、在不同的相中：(2)、酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；(3)、两相用离心机很容易分离。典型的从细胞碎片中分离酶的数据示于表193。通常将蛋白质分配在上相(PEG)，而细胞碎片分配在下相(盐)。反过来的情况对相的分离不利，因为当上相含固量高时，分离机的性能会受到影响。从表193可见，在大多数场合下收率都能达到90，分配系数在120之间，多数场合大于3；很多杂蛋白也能同时除去。PEG盐系统用得很广，主要由于PEG价廉和其选择性高于PEG粗葡聚糖系统的缘故。在萃取时，单位重量相系统中匀浆液的加入量是一个重要的参数。从经济上考虑，当然希望加入的量多一些，但这
16、样会影响原来成相聚合物的相系统，改变相比，或使分配系数降低，结果使收率降低。一般1千克萃取系统处理200到400克湿菌体为宜。在PEG盐系统中要使细胞碎片分配到下相，还是比较容易的。Hustedt等经过系统研究，对PEG1550磷酸钾系统的相图中(图197)，如起始混合物的浓度处在虚线范围内时，细胞碎片都会分配到下相。分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐(有时也可同时加入少量的PEG)，进行第二次两水相萃取。通常第二步萃取的目的系除去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分 配在盐相中，则蛋白质就应留在PEG相中。在第三步萃取中，应使蛋白质分配在盐相(例如，调节pH)，以使和主体PEG分离。色素由于其憎水性通常分配在上相。主体PEG可循环使用，而盐相蛋白质可用超滤法去除残余的PEG以提高产品纯度。（二）、工程方面的问题在进行工业应用时需考虑达到萃取平衡所需的时间和两相分离的设备。在两水相系统中，表面张力很低，很容易混匀与平衡 。如对PEG盐系统表面张力为0.
