《实验十血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验十血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验十 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳1 实验目的 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素 薄膜电泳操作技术； 掌握测定人血清中各种蛋白质的相对百 分含量；2 实验原理醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是 纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微 孔薄膜，厚度约0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分 离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎 。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋 白。血清中含有清蛋白，-球蛋白、-球蛋白、 -球蛋白和各种
2、脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基 酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同 ，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低 、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的 蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清 在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显 示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为1-、 2-、-及-球蛋白（如图3-5）。图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别1-，2-，-及 -球蛋白，6为点样原点 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量 ，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区 带吸收峰及相对百分比。此法由于操作简单，快速
3、，分辨率高及 重复性好等优点。它不仅可用于分离血 清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋 白及同工酶的分离测定。3 实验器材与试剂3 实验器 材与试剂 器材 器材电泳仪及电泳槽（包括直流电源整流器和电泳槽两个 部分，电泳槽用有机玻璃或塑料等制成，它有两个电 极，用白金丝制成。）；醋酸纤维素薄膜（28cm） ；培养皿（直径9-10cm）；解剖镊子竹夹子；点样器 ；直尺和铅笔；玻璃板（1212cm）；试管若干及试 管架；吸量管（2mL，5mL）；可见光分光光度计；吹 风机；单面刀片；普通滤纸及臭氧化缸（可用普通容 器代替） 试 剂 试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子
4、强度 0.06)称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于 三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用 蒸馏水定容至1000mL。置40C保存，备用。 血清蛋白染色染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸 馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混匀 溶解后置具寒试剂瓶内贮存。漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸 馏水50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。透明液：临用前配制。甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混 匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（AR）25mL，
5、无水乙醇（AR）75mL，混 匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。保存液：液体石蜡。定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至 1000ml。4 实验方法与步骤4 实验方法 与步骤 仪器与 薄膜的准备 仪器与薄膜的准备 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿 中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速润湿，整条薄 膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿 缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚 薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约 30min后，方
6、可用于电泳。 电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽 的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与 支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部 润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡 ，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称 为滤纸桥。 电极槽的平衡用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电 极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15- 20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。 点样 点样取一张干净滤纸（1010cm），在距纸边1.5c
7、m处用铅笔划 一平行线，此线为点样标志区。用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的 缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模 板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻璃 棒或血色素吸管取2-3L血清，均匀涂在加样器上，再将点 样器轻轻印在点样区内，如图3-6所示，使血清完全渗透至 薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点 样技术后再正式点样。图3-6 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（ 虚线处为点样位置） 电泳 电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥 上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，
8、如图3-7 所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一 电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。 盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接 ，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳 仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄 膜则为4.8mA）。通电10-15min后，将电流调节到每厘米膜 宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50-80min。 电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。图3-7 电泳装置剖视示意图 1.纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央
9、隔板 染色与漂 洗（血清蛋 白染色与漂 洗脱色） 染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑 10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后再用漂 洗液浸洗脱色，每隔10min换漂洗液一次，连续 数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干 。图 3-8 血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 图谱比较示意图 a.蛋白染色 b.脂蛋白染色 透明 透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙 液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不 能有气泡，约2-3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在
10、薄膜表面淋洗一次， 垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用 单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用 滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min， 再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保 存不褪色。 结果 判断与 定量 结果判断与定量一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示5条区 带，其排列顺序见图3-8a，未经透明处理的电 泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组 分相对百分含量。本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫 描仪进行扫描
11、定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进 行定量。下面为后者的具体操作步骤：取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4N氢氧化钠 4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均 大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动 ，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色， 波长用650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白 蛋白A、1、2、球蛋白各管的光密度。 光密度总和TA+12 各部分蛋白质的分数为：A（清蛋白）% = A / T1001-球蛋白 % = 1 / T1002-球蛋白 % =2 / T100-球蛋白 % = / T100-球蛋白 % = / T100 附：迁移率是胶体
12、颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质 等物质以及研究它们的某些理化性质现将人血浆蛋白质 的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。蛋白质名称等电点泳动脉/(cm2V-1S- 1)分子量清蛋白4.88-5.910-5690001-球蛋白 5.06-5.110-52000002-球蛋白5.06-4.110-5300000-球蛋白5.12-2.810-59000-150000-球蛋白6.85-7.50 -1.010-5156000-300000纤维蛋白元5.40-3.110-5正常值：白蛋白5772% 1球蛋白252球蛋白49 球蛋白6.512 球蛋白1220表3-12 人血浆蛋白质的等电及迁移率备注
13、备注： 醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上 电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过70 。-，-，和，都偏低，个别正常人球蛋臼 可低到12左右。上述正常值仅供参考。 经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95乙醇（2:8） 溶液中20分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过 程中，薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘 出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数 。目前国内已有自动定量的光密度计生产。此透明薄膜 可长期保存，供教学示教用。5 注意事项5 注意事项 醋酸纤维 素薄膜的预 处理 醋酸纤维素薄膜的预处理薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片 漂浮
14、于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度 ，如漂浮15-30s时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条 纹，这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后 区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓 冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品 不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影 响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹污染， 取膜时，应戴指套或用夹子。 缓冲液的 选择 缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥缓冲液，其浓度 为0.05-0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的厚薄有 关。在选
15、择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间 的膜长度为8-10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为 0.4-0.5mA/cm膜宽。当电泳时达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或 进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于 扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分 布过于集中，不易分辨。加样 量加样量加样品量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手 段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量 则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不 清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。 如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品10.-5L ，相当于
16、5-1000g的蛋白，血清蛋白常规电泳分离时，每厘 米加样线加样量不超过1L，相当于6080g的蛋白质。但 糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量 均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时， 动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而 影响电泳区带分离效果。 电量的 选择 电量的选择电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强 度为0.4-0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的 环境中，可引起蛋白变性或由于热效应引起缓 冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜 片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩 散。 染色液 的选择 染
