蛋白质沉淀技术

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1、蛋白质沉淀技术一、蛋白质的基本性质+蛋白质是人体机能构成成分,人体任何器官 和组织都是以蛋白质作为重要组成成分。 鉴于蛋白质重要性研究蛋白质分离十分必 要。1、胶体性质+蛋白质表面有一些亲水基团易起水合作用 ，从而形成水化层，导致蛋白质颗粒不易 聚集沉淀，这些蛋白质分子直径在220nm 范围，所以蛋白质溶液是亲水胶体，具有 半通透性，丁达尔效应、布朗运动等一些 亲水胶体性质 。1 杨丰科.系统有机化学M.北京:化学工业出版社 ,2003433 一 435.2、两性解离和等电点+蛋白质可解离基团包括末端-氨基和末端 -羧基及可解离侧链R基。这些可解离基 团在特定的PH范围内解离，产生带正电荷 或

2、者带负电荷的基团。当溶液PH使蛋白质 所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质 分子本身净电荷为零，此时PH即为该蛋白 质分子等电点，用PI表示，测PI时一定在 缓冲液中进行，因为离子强度可以使PI改 变 。1 杨丰科.系统有机化学M.北京:化学工业出版社 ,2003433 一 435.两性解离和等电点3、沉淀作用+沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解 度降低，形成固相从溶液中析出从而达到 分离的一种技术。+沉淀分离方法和其他分离方法相比，优点 是过程简单、成本低、原料易得，便于小 批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀 越有利、收率越高；缺点为过滤困难、产 品质量较低，需重新精制。4、变性作用+天

3、然蛋白质受物理或化学因素影响，蛋白 质分子内部维系其高级结构原有氢键、盐 键等次级键遭到破坏，使分子内部结构发 生改变，导致其生物学性质、物理化学性 质改变，这种现象称为蛋白质变性作用。5、凝固作用+变性蛋白质分子相互凝聚或相互穿插缠绕 在一起的现象称为蛋白质凝固，例如生鸡 蛋蛋白溶液受热变为蛋白块现象。6、颜色反应+蛋白质颜色反应实际上是氨基酸一些基团 肽键等与一定试剂所产生化学反应。二、蛋白质沉淀分离技术+蛋白质胶粒上同性电荷互相排斥，不易凝 聚成团下沉；蛋白质表面许多亲水基团水 合作用形成一层水化膜,在胶粒之间起隔离 作用，蛋白质在水溶液中,虽分子量很大, 但仍能维持稳定溶解状态。若能除

4、去其水 化膜并中和其电荷,则蛋白质可从溶液中沉 淀而出。常用有以下几种沉淀方法：蛋白质沉淀分离常用方法+1、盐析法+2、有机溶剂沉淀法+3、等电点沉淀法+4、变性沉淀分离技术+5、复合盐沉淀法1、盐析法（中性盐沉淀）一般来说,所有固体溶质都可在溶液中加入中性 盐而沉淀析出,这一过程称之盐析。（1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理a.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低， 静电排斥作用减弱。b.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋 白质争夺水分子。2 李冬梅,张锦茹,田 园.蛋白质沉淀分离J.粮食与油 脂,20079 一 11盐析法盐析机理示意图盐析法（2）中性盐的选择原则a.要有较强的盐析效果

5、。一般来说，阴离子影响盐析的效果比阳离子显著，且含高价阳离 子的无机盐比含低价阳离子的无机盐效果好。b.要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响尽可能地小。便于获得高浓度的盐溶液，尤其是在低温时，不至于造成盐结晶 的析出。c.不影响蛋白质等生物大分子的活性，并且，最好不引入给分离或测定 带来麻烦的杂质。d.来源丰富，价格低廉。盐析法常用的中性盐有：(NH4)2SO4 ，Na2SO4 ，NaH2PO4 等。其中 最重要的是(NH4)2SO4。优点：溶解度大 ；尤其是在低温时仍有相当高的溶解度分离效果好；有稳定蛋白质结构的作用，不易引起变性；价格便宜；废液可以肥田，不污染环境。缺点：硫酸铵水解后变酸

6、，在高pH值下会释放出氨，腐蚀性 较强，因此，盐析后要将硫酸铵从产品中除去。盐析法（3）影响盐析的因素a.蛋白质浓度一般较适当的样品浓度是2.5%-3.0%，通过实 验确定。b.离子强度和类型 一般来说,离子强度越大,蛋白质溶解度越低。 下面为几种盐盐析能力排列次序:磷酸钾 硫 酸钠磷酸铵柠檬酸钠硫酸镁3 Gelazka V B ,Smith D D S ,Ledward D A ,et al .Influence of high pressure on protein-polysaccharide interactionsJ . Pros.Int.Conf ,1998,24:397-400.

7、盐析法c.pH值一般来说,蛋白质所带净电荷越多,溶解度越大；净电荷 越少,溶解度越小,在等电点时蛋白质溶解度最小,为提高 盐析效率,多将溶液pH值调到目的蛋白等电点处。d.温度在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温 度增加而增加;但在高浓度下,蛋白质、酶和多肚类物质 溶解度随温度上升而下降。在一般情况下,蛋白质对盐析 温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度较敏 感酶要求在04进行。盐析法（4）脱盐常用的脱盐处理方法有：透析法、超滤及凝胶过 滤法。透析最早应用的膜分离技术。2、有机溶剂沉淀法（1）有机溶剂沉淀机理：降低水的介电常数,导致 具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集

8、,最后 析出。+该法优点在于：a.分辨能力比盐析法高,即蛋白质 只在一个较窄有机溶剂浓度下沉淀;b.沉淀不用脱 盐，过滤较为容易。+其缺点是对具有生物活性大分子易引起变性失活, 操作要求在低温下进行。+总体来说,有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍 。2 李冬梅,张锦茹,田 园.蛋白质沉淀分离J.粮食与油 脂 ,20079 一 11有机溶剂沉淀法+(2)有机沉淀剂+有机沉淀剂有乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺 、二甲基亚砜、异丙酮等, 其中最常用的是乙醇 和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇, 由于 甲醇、丙酮均有一定毒性, 故使用时必须谨慎。有机溶剂沉淀法+(3)有机沉淀剂分离技术的影响因素温度低温，

9、而且要保持温度的相对对恒定。样品浓度蛋白质质: 0.5%-2%;黏多糖1%-2%pH保证待沉淀物稳定的前提下，接近等电点离子强度重要因素，一般以0.01mol/L-0.05mol/L为为宜金属离子钙离子、锌离子等， 可与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物有机溶剂沉淀法+(4) 应用实例+应用实例有高粱蛋白质的提取, 其基本工艺流程 为: 高梁粉萃取离心沉淀水洗烘干44 张伟敏,谭小蓉,钟 耕.高粱蛋白质研究进展J.粮 食与油脂,2005(1):7- 9.3、等电点沉淀法+（1）等电点沉淀法的原理等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零 时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电 位降低，吸引

10、力增大，能相互聚集起来，沉淀 析出，此时溶质的溶解度最低。等电点沉淀法+（2）等电点沉淀法的影响因素 a.杂质种类的影响 混合液中存在许多等电点相近的两性电解质，单 独使用此法效果差。 b.离子强度的影响 蛋白质有盐溶和盐析两面性，等电点的数值随着 溶液中中性盐离子的种类和浓度变化而变化，所 以离子强度对等电点的沉淀作用影响较大。 c.溶质表面极性的影响 等电点沉淀法适合于疏水性较大的蛋白质（如酪 蛋白），因其表面水化层相对较薄。而亲水性较 强的蛋白质在等电点下不容易产生沉淀，这时 需要结合其他方法一起使用。等电点沉淀法+(3) 应用实例应用实例有大豆蛋白的 碱提酸沉法, 基本工艺流 程为:

11、豆粕原料二次碱提粗滤酸沉打浆 回调改性喷粉成品55 高孔荣, 黄惠华, 梁照为. 食品分离技术 M . 广州: 华南理工大学出版社, 1998: 12- 15.4、变性沉淀分离技术（1）基本原理利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境 因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生 变性形成沉淀, 而另一些组分保持不变, 从而 达到分离、除杂和提纯的目的。变性沉淀分离技术（2）变性沉淀分离的方法a.热变性沉淀分离: 利用蛋白质热稳定性不同的特 点, 使蛋白质组分之间得以分离, 同时使蛋白质与 水及其他可溶物分离, 此法常用于组织化植物蛋白 的生产6 。6 张建云, 邱 坚, 李正红,等.木豆叶蛋白提

12、取工艺研 究J .西南林学院学报, 2001, 21( 1) : 40- 44.变性沉淀分离技术+b.选择性酸碱变性沉淀分离:利用酸碱变性原理, 通过调节溶液 pH 值, 可有选择地去除杂蛋白, 常用于生化制备中7 。c.利用酶进行变性分离:利用酶的催化作用使一些 蛋白质变性, 从而沉淀分离, 如凝乳酶催化牛乳 酪蛋白的沉淀。7 刘 芳, 敖常伟. 刺槐叶蛋白提取工艺条件的初步 研究J . 中南林学院学报, 1999, 19( 1) : 64- 67.变性沉淀分离技术+d.利用表面活性剂或有机溶剂引起变性沉淀分离:在制备核酸时, 可加入含水酚、氯仿以及十二烷 基磺酸钠等试剂, 有选择地使蛋白质

13、发生变性沉 淀, 达到去除杂质、提纯核酸的目的。变性沉淀分离技术(3)影响蛋白质变性的因素a.温度。在较高温度作用下, 蛋白质的二级、三级 和四级结构的弱键断裂, 破坏了肽链原来特有的排 列和空间结构, 使原来在大分子内部的极性基团转 到分子表面, 促进蛋白质分子相互凝集而沉淀, 但 温度过高又会使蛋白质发生变性。变性沉淀分离技术+b.pH值。+大部分蛋白质在 pH 410 的范围内是比较稳定 的,超过这个范围强酸或强碱会使蛋白质分子内的 基团带电性质发生变化, 从而破坏静电引力所形 成的键,使原来的构象发生变化, 导致蛋白质变性+c.其他化学因子。5、盐复合物沉淀法+a. 金属复合盐法:+许

14、多有机物质包括蛋白质在内,在碱性溶液中带负 电荷,能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们 之间作用机制,可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合 物,如铜、锌、锅;亲羧酸疏含氮化合物类,如钙、 镁、铅;亲硫氢基化合物类,如汞、银、铅等。蛋 白质一金属离子复合物重要性质是对溶液介电常 数非常敏感,调整水溶液介电常数(如加入有机溶 剂),即可沉淀多种蛋白。复合盐沉淀法+b.有机盐法:含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、靴酸 等能与有机分子碱性功能团形成复合物而沉淀析 出。但此法常发生不可逆沉淀反应,故用于制备蛋 白质时,需采用较温和条件,有时还需加入一定稳 定剂。+c.无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钥酸盐等。若 为有机酸盐或磷钨酸盐,则加入无机酸并用乙醚萃 取,把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去,或用离 子交换法除去。值得注意的是此类方法常使蛋白 质发生不可逆沉淀,应用时必须谨慎。介绍几 种蛋 白质沉淀分离方法,在实际操作 中都较容易应用,但存在着很多不足,相信随 着科学技术发展和 经济水平提 高,将完善这 些不足,使 其更 广泛应用 到生产实践中去。谢谢