液相色谱柱子使用及保养

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1、液相色谱实用技术色谱柱的使用和保养色谱柱的选择t非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱t酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18 柱，PH范围2-9（12）t糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱键合相色谱柱t以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基 等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料 的60-70%t优点固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响t缺点 pH值不能小于2或大于8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相HPLC柱（C18）的性能 t常规C18填料的稳定性 硅胶基质填料 pH范围：2-8 pH值大于7时 键合相粉碎

2、或溶解 pH值小于2时 键合相的化学键断裂 经常用缓冲液固定相降解t填料新的键合技术- PH范围 2-12- 稳定性好，使用寿命长良好的色谱实验习惯t拿到一根新色谱柱时，先测柱效t保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件t定期检测柱效色谱柱的使用及操作t流动相的转换 特别是GPC柱t流速(压力)的变化幅度t温度的变化幅度t专用色谱柱样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）t样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度， 防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用样品准备为什么溶剂和样品要过滤?t溶剂和样品过滤非常重要，它会对色

3、谱柱、仪器起到保护 作用，消除由于污染对分析结果的影响。 t色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样 品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 t仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨 损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型： t30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m 和0.45m 两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体 积少于50l。 t13mm 内径：适用于范围广的过滤，由0.2m 和0.45m 两种规格,材料为纤维素。 t3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m 和0.45m 两种规格。处理样品体积为

4、7l。色谱柱的保养（二）t流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检 验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例溶剂过滤-除去微粒t不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶 剂过滤器以及色谱柱。 t遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和 色谱柱的寿命： t 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 t 用滤膜过滤溶剂去除微生物。 t 每两天更换或过滤溶剂。 t 避免溶剂瓶直接日照。 t 向溶剂中加入0.0001

5、-0.001M的叠氮化钠。t 溶剂准备：过滤选择合适的滤膜t聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可 溶物。t醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推 荐用于蛋白质和其相关的样品。t尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于 强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺t再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性 样品和有机溶剂。t注意：1）每张滤膜只能用一次。t 2）水相和有机相不要搞混。溶剂的相溶性溶剂信息t避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：t卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。t高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。t能够形成卤素自由基或酸的氯化试

6、剂及其混合物。t含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。t在有机溶剂中的有机酸溶液。t含有强络合剂的溶液。t四氯化碳和异丙醇或THF混合液。溶剂截止波长溶剂准备：脱气流动相使用前为什么要脱气？t流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶 解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相 由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。 气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无 法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧 化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若 用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：t氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹 氦脱气，效果较好，但成

7、本高。t加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染t抽真空脱气法：易抽走有机相。t超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10 -15min，此法效果最差。t在线真空脱气法：LC 真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱 气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于 以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。 典型的流速流动相的保存t有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存 t缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌 t有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发 t选用适宜的容器2 星期1 天1 星期1 小时 新鲜配制510152

8、0250 分保存于聚乙烯瓶中的超纯水测试条件测试条件 水样水样: 40: 40ml trace enrichment 2.0 ml/minml trace enrichment 2.0 ml/min 色谱柱色谱柱: : C18 C18 反相柱反相柱 ( (Waters)Waters) 梯度梯度: : 线性线性 100% 100% 水水 100% 100% 乙腈乙腈 波长波长: 254 : 254 nmnm1 天1星期新鲜配制5101520250 分保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件测试条件 水样水样: 40: 40ml trace enrichment 2.0 ml/minml trace

9、 enrichment 2.0 ml/min 色谱柱色谱柱: : C18 C18 反相柱反相柱 ( (Waters)Waters) 梯度梯度: : 线性线性 100% 100% 水水 100% 100% 乙腈乙腈 波长波长: 254 : 254 nmnm色谱柱日常使用t过滤所有的溶剂和样品t使用保护柱t不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液t开机时，流速和柱压要逐渐增加t进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液t注意色谱柱的pH值使用范围t不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子t关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗t不要高压冲洗柱子色谱柱保护在线的保护装置t给色谱柱提供物理的保护

10、 除去样品及流动相中的颗粒t给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染t装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱新型的保护柱t特点 高质量, 高效填料 - 不损失柱效 增加分析柱效 - 增加适应范围 20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保护 柱寿命 手可拧紧接头，安装时不需要工具 通用柱套 - 适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径) 整体式- 使用方便，容易 各种不同填料配合色谱柱色谱柱常见毛病t柱压过高 多少才算高?不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异t柱效低t重复性差t不出峰，回收率低柱压过高t 为什么柱压会过高微粒堵塞样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸

11、附细菌生长柱效低t为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯重复性差、回收率低t实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定t回收率低，不出峰 “不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附色谱柱的日常清洗t对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗（如反相C18柱用100% 甲醇或乙腈） t硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲

12、烷、正庚烷 100200ml依次活化 t键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积150x4.6mm 2.5ml 50ml200x4.6mm 3.3ml 65ml250x4.6mm 4.2ml 80ml *再有杂质严格清洗： 20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫 酸，最后用流 动相清洗色谱柱的清洗-物理阻塞l在安装柱前后测试压力差l如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的 流动相冲洗色谱柱，监测压力变化l若出现沉淀 (如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物) 设法用相应的可溶性溶剂，如 0.1% TFA/ 80% 乙腈,

13、6M 盐酸胍, THF, HFIPl若仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱头塌陷的修补柱头有塌陷可用填料修补：1）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上柱入口接头，把柱重新接到LC仪器上慢慢地增加流速，直到操作上限为止。2）如果柱头塌陷较深（小于1cm）可逐渐减低流速至零，再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。色谱柱的存放t存放前的处理 除去杂质、盐等，防止细菌生长t合适的存放溶剂t两端密封保存，避免色谱柱床干枯t避免机械震动t注意存放的温

14、度色谱柱以外的因素（一）t“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大色谱柱与仪器的联接t不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造 成： 色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏t解决办法： 使用“通用”型接头（锥箍及螺母）这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的 色谱系统及色谱柱。PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的 色谱柱上的。色谱柱以外的因素（二）t柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误?色谱柱以外的因素（三）t实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足手动进样器-六通阀的结构手动进样器清洗为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含盐）冲洗