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1、Gene of InsertGene of Insert腺病毒表达系统腺病毒表达系统质粒型表达载体病毒型表达载体真核生物细胞常用的表达载体 腺病毒表达载体 逆转录病毒表达载体 昆虫杆状病毒表达载体病毒表达系统的特点n高转染效率n高蛋白表达水平n对转染效率很低的细胞进行高效转染 (原代细胞等)n稳定,可遗传的表达 (逆转录病毒)n可控制拷贝数如何选择合适的病毒表达载体？ 可适用的宿主细胞类型 选择标记 插入片段的大小 调控元件 报告基因病毒表达载体的用途基因治疗1990年French等把腺嘌呤脱氨酶基因导入到一名4岁小女孩的T 淋巴细胞中治疗了腺嘌呤脱氨酶基因缺失病,开创了人类利用人 体基因治疗
2、疾病的先例。1992年复旦大学薛京伦等首次把人凝血因子基因成功用于治 疗血友病。2005年第一个批准上市的基因治疗制品Adv-P53在中国上市。病毒载体疫苗重组腺病毒的作用 n在哺乳动物细胞中，AdV已被成功应用于表达各种病毒 和细胞的基因，腺病毒表达载体系统表达出蛋白的生 物化学特性，可用于商业价值的开发，它可用来生产 亚单位疫苗，和新型诊断试剂盒的开发。nAdV可以通过转染细胞来表达蛋白，除基因治疗的相关实验外还可用做体内特性研究。 被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓 纯化腺病毒的电子显微照片 被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠纹状体的切片 用AdV转染基因的优点n速度快，简单，不需
3、要任何特殊的装备。n相对其它方法，它非常容易被接受。事实上，这种感 染后细胞生存率几乎为100%。因此，AdV有向细胞内转染遗传物质而忽视毒性作用的能力。n许多细胞类型均可被转染。n感染后的数小时，基因表达便可被分析。n刺激后，可有一种以上的基因被同时表达。腺病毒颗粒比较稳定,病毒基因组较少发生重排。插入外源基因的病毒基因组在连续传代中一般保持不变。 腺病毒基因组较易操作。 制备大量的腺病毒较为容易。 可感染分裂细胞和非分裂细胞。rAds可转导肺细胞、肝细胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等。重组腺病毒表达系统重组腺病毒表达系统n通过对本体蛋白的同样的翻译后的修饰，在细胞 中表达真核蛋白
4、。n 一系列腺病毒转换因素允许产生高水平的异种蛋 白。重组蛋白代表了整个细胞蛋白的最丰富的多 肽（20%-30%）。n在较好的条件下，表达系统在数升的293细胞悬浮 培养液中可以按比例地增加，产量可达90mg/L。 腺病毒表达系统腺病毒属于无包膜病毒,外壳由240个六邻体和12个五邻体构成二十面体结构,内部有约36kb的线性双链基因组,属于DNA病毒。外壳的五邻体分别位于二十面体结构的顶角、均有一个纤突蛋白(fiber)突起与其相连,腺病毒的组织亲合性与纤维蛋白头部密切相关。 腺病毒的特性腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白,分为早期表达和晚期表达。早期表达的蛋白是功能蛋白、晚期表达的
5、有 功能蛋白和结构蛋白,并且早期的功能蛋白调控晚期蛋白的表达。早期表达的1区蛋白(甚至包括2区蛋白)是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达翻译所必需的,但其对细胞的毒性也是很强的。E2蛋白涉及AdDNA复制, E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统, E4调节有效的晚期基因转录。腺病毒的基因及其功能腺病毒感染细胞的第一步是通过纤突蛋白与细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)结合。腺病毒粘附后,五邻体蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸（)与细胞表面的整合素3和5结合并相互作用使病毒进入细胞。 病毒的受体与入侵细胞的过程第一代腺病毒载体中,1、3基因表达盒已经去除了,这样可以插入长约8kb的外源D
6、NA。 去除1区还有一个优势,就是阻止了依赖1区和2区功能蛋白的转录和随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。 1区缺失的腺病毒可以在能够反式提供1区基因蛋白的293细胞中得到增殖。 第一代腺病毒载体腺病毒基因组结构与载体改造nHEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus E1a/E1b genesnE1a/E1b genes (integrated into 293 genome) allow replication and transcription of Adenovirus构建重组腺病毒 构建重组腺病毒的传统方法是以
7、同源重组为基础的。n其一用修饰的腺病毒DNA与穿梭载体在HEK 293细胞中进行同源重组；n通过Cre-loxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都 插入loxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞 ，通过Cre介导两个loxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒 ，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。 n更为流行的方法采用了穿梭载体与腺病毒质粒转化一种特殊的菌株(BJ 5183)。然后从细菌中收集重组腺病毒，用其感染HEK 293细胞。Adeno-X Expression SystemAdeno-X Expression System同源重组体外
8、连接法Viral DNAPlasmid-based 制备穿梭载体和 腺病毒载体7-14天7-14天2-3天目的基因从穿梭 载体克隆到腺病 毒载体-0-15天4天获得重组腺病毒14-21天17-22天4-7天噬斑纯化5-10天0-5天-总计26-45天24-56天10-17天构建重组腺病毒不同方法比较 Ad5腺病毒可感染的寄主人体各类组织的细胞，除造血细胞外多种哺乳动物细胞：Plate 293 cells 5x105/wellInfect cells w/ virus dilutionsHexon proteins expressedFixAdd primary anti-hexon AbAdd
9、 HRP conj. secondaryDevelopCountAdeno-XTM Rapid Titration Kit 简单的免疫染色方法 整个过程只需48小时. 而传统繁琐的方法需要2个星期才能完成 对所有重组的Ad5病毒能实现准确而快速的滴度测定Adeno-XTM Rapid Titration Kit 的特点Adeno-XTM Rapid Adenoviral purification System第二代腺病毒载体是病毒基因组的E2A区缺失,并突变或缺失E4区基因。这种载体装载容量有所增加(可达11kb) ,细胞毒性和免疫原性有所减弱,而目的基因的表达时间更长。第二代腺病毒载体一种研
10、究方向：改造腺病毒囊膜表面五邻体纤维蛋白的结构。根据Adv5纤突蛋白结节区的结构特征,去除病毒与受体(CAR,柯萨奇2腺病毒受体)的亲和性,经特异性细胞结合分子模拟腺病毒纤突衣壳蛋白,使载体选择性靶向相应细胞,减少载体的非特异性感染及免疫反应。提高腺病毒载体的靶向特异性另一种改造策略：改造腺病毒的基因结构,置换上针对癌细胞的特异型启动子。如装上AFP启动子,使载体特异性感染肝癌细胞。提高腺病毒载体的靶向特异性宿主的免疫反应仍然是获得转基因长期表达和重复使用腺病毒载体的主要障碍。大量研究已证实,具有感染性的腺病毒载体本身就足以引起免疫反应。更为“复杂”的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体,在其构建时
11、去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因。所谓的“空壳”载体起先只保留了和包装信号,且在产生中需要辅助病毒和合适的互补包装细胞,更需要进一步的纯化。 第三代腺病毒载体第三代新型重组腺病毒载体删除病毒基因中所有开放阅读框,仅含有必要的顺式元件(即ITR和邻近的包装信号序列) ,需要在辅助病毒存在情况下,在包装细胞中繁殖,其安全性很高。第三代腺病毒载体不但可容纳较大的外源基因(32kb) ,而且较容易获得高滴度( 109pfu /ml) 。第三代新型重组腺病毒载体腺病毒在寄主细胞中呈游离 态，基因瞬时表达可侵染处于分裂期或非分裂 期的寄主细胞高水平的蛋白质表达双载体系统的操作 病毒的效价可达
12、 1012 pfu/ml平均可插入8kb的外源片段长期、稳定的基因表达，可 以遗传只能侵染分裂期的寄主细胞中度的蛋白表达水平单一载体操作 病毒效价达 106 pfu/ml平均可插入6.5kb的外源片段腺病毒表达系统 逆转录病毒表达系统 Adeno-X VS Retrovirus Expression SystemRetroviral Expression System逆转录病毒表达系统 Env、pol、gag为RNA病毒中控制复制和表达外膜蛋白的基因。 重新构建的反转录病毒载体将去除gag、pol、env基因，并将它们整合到包装细胞株的基因组中。 +是RNA病毒包装时的识别序列，保留在反转录病
13、毒载体中。逆转录病毒载体的构建和改造逆转录病毒的 包装过程Retro-X Retroviral Expression VectorsLRCX Retroviral Expression VectorsMSCV Retroviral Expression System小鼠干细胞病毒表达载体造血细胞胚胎干细胞胚胎性癌细胞Pantropic Retroviral Expression System宿主范围广泛嗜性逆转录病毒 表达系统为什么泛嗜性逆转录病毒的宿主范围如此广？n外膜蛋白识别宿主细胞表面的受体nVSV-G外膜蛋白不需识别宿主细胞表面的受体nPackage cell line GP2-293
14、整合有gag-pol 基因npVSV-G 载体与pLXRN 载体共转化Pantropic Retroviral Expression SystemPackage Cell Line GP-293pLXRNpVSV-GPantropic Retroviral Expression Vector泛嗜性逆转录病毒载体带GFP报告基因的逆转录病毒载体RevTet-On & Off Gene Expression SystemPcmvtetRVP16TREPmincmvGene of InteresttetR： Tc抑制因子VP16：转录激活亚基tTA： Tc应答转录激活因子：四环素或DoxtTAtTA
15、RevTet-Off Gene Expression SystempTet OffpTRE2RevTet-On Gene Expression SystemPcmvr tetRVP16TREPmincmvGene of InterestrtetR： 反Tc抑制因子VP16：转录激活亚基rtTA： 反Tc调控的转录因子： DoxrtTArtTApTRE2pTet OnRevTet-Off & On Gene Expression System在各种细胞系中建立可调控的基因表达系统Tc 或 Dox 诱导所需的剂量远小于细胞毒素的水平，不会影响细胞的生长。外源基因表达为激活方式，容易控制。表达水平相比其他组成型的真核强启动子要高几十倍。基因表达受到严谨的调控，可以表达毒性基因等谢 谢
