聚合酶链反应PCR技术及其应用

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1、 目目 录录PCRPCR技术简史技术简史 PCRPCR的原理的原理 PCRPCR的反应体系和方法的反应体系和方法 PCRPCR的的类型和应用类型和应用PCR技术简史DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了

2、 聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryKary B. Mullis B. Mullisof the Polymerase Chain Reaction19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大为十余项重大 科学发明之首科学发明之首, ,比喻比喻19891989

3、年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣荣 获获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。生物样品生物样品DNADNA片段片段基因诊断基因诊断基因治疗基因治疗基因工程产品基因工程产品法医学检测法医学检测人类学研究人类学研究基因组基因组DNADNA获取特定获取特定DNADNA片段片段扩增特定扩增特定DNADNA片段片段引物引物MullisMullis 的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段949455553737TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermusthermus aquaticusaquatic

4、us) )酶酶活性活性(%)(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 10010080604020727294945555PCRPCR循环循环PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特

5、点适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复13步 2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链 与引物复性DNA变性 形成2条单链子链延伸 DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复13步 2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链 与引物复性子链延伸 DNA加倍DNA变性 形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特

6、点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点重复30轮后 230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增 第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn 循环次数实际拷贝数=(1+x)nX 平均效率,约为0.85n 循环次数PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过

7、程 PCR的特点灵敏度高 1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6) 水平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA引物设计引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源 序列。序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 15-40 bpbp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽

8、可能随机分布，G+CG+C占占50-60%50-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；55端端无严格限制。无严格限制。33553 5 5限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1）模板）模板单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、 DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。

9、一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCRPCR反应条件反应条件（2 2）引物浓度）引物浓度0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配, ,反应特异性反应特异性 下降。下降。（3 3）TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermusthermus aquaticusaquaticus) )0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降; ;酶量过

10、少影响反酶量过少影响反 应产量。应产量。（4 4）dNTPdNTPdNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量低则降低反应产量dNTPdNTP可与可与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降浓度下降 ，影响，影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5 5） MgMg2+2+MgMg2+2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L0.5mmol/L-2.5mmol

11、/L反应体系。反应体系。MgMg2+2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降产量下降 ； MgMg2+2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。MgMg2+2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTPdNTP、 EDTAEDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的MgMg2+2+浓度。浓度。2 2）循环参数）循环参数(1)(1)变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链9595o oC 20-30C 20-30秒秒(2) (2) 退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定

12、。增加温度能减少引物与模板的非特异性结增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合合; ;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。（3 3）延伸）延伸70-7570-75o oC C，延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4）循环次数）循环次数主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度一般为一般为25-3525-35次次次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加错误掺入率增加PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标

13、本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他1 1）不对称）不对称PCRPCR目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限 制性引物和非限制性引物制性引物和非限制性引物, ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是 0.010.5M,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针制备杂交探针基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物2)2)反向反向PCR (rever

14、se PCR) PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片片 段对某个已知段对某个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析, ,如探索邻接已知如探索邻接已知 DNADNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNAcDNA的的 克隆克隆, ,扩增基因文库的插入扩增基因文库的插入DNADNA；建立基因组步移文建立基因组步移文 库。库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序

15、列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶3 3）多重）多重PCRPCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电 泳泳引物引物4 4）LP-PCRLP-PCR（LabelledLabelled primers) primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记 ，用以直观地检测目的基因。，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物5 5）锚式）锚式PCRPCR已知靶基因片段两测的序列 VHVHCH1CH1CH1CH1CH2CH2CH2CH2CH3CH3CH3CH3VHVH VLVLVLVLCLCLCLCLcDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGG CCCCCCCC6 6）P