目的基因导入受体细胞

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1、第七章 目的基因导入受体细胞第一节 受体细胞1)Receptor cell: 宿主细胞或寄主细胞能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应 用价值和理论研究价值的细胞。2)受体细胞的选择应符合的基本原则:v 便于重组DNA分子的导入v 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中v 便于重组体的筛选v 遗传稳定性高,易于扩大培养或发酵生长 v 安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生物污染v 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞,利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累,或促进外源基因的高效分泌表达v 受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏歧性v 具有较好的转译后加工机制,便于真核目的基因的高效表达v

2、在理论和生产实践上有较高的应用价值受体细胞的类型:* 原核生物受体细胞 * 植物受体细胞* 动物受体细胞一、原核生物细胞1、是较为理想的受体细胞类型,因为: 大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁,便于外源DNA的进入。 没有核膜,染色体DNA没有固定结合的蛋白质,这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单,不含线粒体和质体基因组,便于对引入的外源基因进行遗传分析。 原核细胞多数为单细胞生物,容易获得一致性的实验材料,并且培养简单,繁殖迅速,实验周期短,重复实验快。2、表达真核生物基因也存在一定的缺陷有为数不少真核生物基因不能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的功能蛋白。

3、其原因是: 原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统,即使许多真核生物基因能得以表达,得到的也多是无特异性空间结构的多肽链; 原核生物细胞缺乏真核细胞的蛋白质加工系统,而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用; 原核细胞内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白,造成表达产物不稳定等。这制约了原核受体细胞作为生物反应器进行异源真核生物蛋白的大规模生产。3、至今被用作受体菌的原核生物大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等 1)大肠杆菌v 属于革兰氏阴性菌,一些菌株的染色体DNA已测序完毕,其中K-12MG1655菌株的全基因组长约4000kb,共含有4405个开放阅读框

4、架,大部分基因的生物功能已被鉴定。大肠杆菌繁殖迅速,培养简便,代谢易于控制。 2)枯草杆菌,又称枯草芽孢杆菌,一类革兰氏阳性杆菌,作为基因工程受体菌的最大优势是: n 枯草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因,能将基因表达产物高效分泌到培养基中,大大简化蛋白表达产物的提取和加工处理等,而且在大多数情况下,真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然构象和生物活性。v 枯草杆菌不产生内毒素,无致病性,是一种安全的基因工程菌。 v 枯草杆菌具有芽孢形成能力,易于保存和培养3)蓝细菌,也称为蓝藻 在细胞结构和生物化学方面与细菌很相似,亲缘关系也较为密切。作为基因工程受体细胞的最大特点是: 蓝藻是一类光能

5、自养型生物,由于具有叶绿素a等光合色素(缺少叶绿素b)而能进行光合作用,同时释放出氧气。因此蓝藻培养简便易行,营养条件要求低,并可用于大规模生产。 由于密码子的偏向性和启动子的通用性,某些蓝藻可能成为植物基因表达的宿主。此外,将重组DNA分子导入棒状杆菌和链霉菌等受体细胞,构建的工程菌可用于抗生素和氨基酸的生产,这是利用大肠杆菌和枯草杆菌等受体细胞难以完成的工作,也具有重要的经济价值。v 真菌是低等真核生物,其基因的结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征,因此利用真菌细胞表达高等动物基因具有原核生物无法比拟的优点。常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞等。二、真菌细胞v 酵母菌是一

6、群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物。它是外源真核基因最理想的表达系统,其优势是: 酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相对较为简单。 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 不含有特异的病毒,不产生毒素,有些酵母菌属(如酿洒酵母等)在仪器工业中有着几百年的应用历史,属于安全型基因工程受体系统。 培养简单,利于大规模发酵生产,成本低廉。 能将外源基因表达产物分泌至培养基,便于产物的提取和加工等。在基因工程研究和应用中,酵母菌具有极为重要的经济意义和学术价值。v 作为基因转移的受体细胞,植物细胞最突出的优点就是其全能性,即一个分离的活细胞在合适的培养条件

7、下,较容易再分化成植株,这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。v 具有坚硬的细胞壁,可用纤维素酶处理获得原生质体。三、植物细胞v 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、HeLa细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等v 以动物细胞,尤其是哺乳动物细胞作受体细胞的优点是: 能识别和除去外源真核基因中的内含子,剪接加工成成熟的mRNA。四、动物细胞 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵 母的1620倍。 易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中,便于提纯和加工,成本低。缺点

8、是组织培养技术要求高,如培养和筛选一个高度扩增的转化子CHO细胞,通常需要数之久,难度较大。 一、重组质粒DNA分子转化大肠杆菌重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞,并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化(transformation)。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞,而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。第二节 重组DNA分子转入生物细胞以革兰氏阳性细菌为例,细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤: 细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞时,受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白,又称为感受因子,其功能是与细胞表面特异受体结合,诱导细菌自溶素等

9、特异蛋白的合成,使细菌细胞处于感受态,极易接纳周围环境中转化因子以实现转化。 转化因子的吸收。受体细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,然后激活邻近的核酸酶,将双链DNA分子中的一条链逐步降解,同时将另一条链逐步转移到受体菌内。 整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离和蛋白因子结合,形成整合复合物前体,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处。 单链DNA转化因子的整合。通过同源重组,置换受体细胞染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链DNA结构。 转化子的形成。受体菌染色体组进行复制,杂合区段亦阻碍之进行

10、半保留复制,当细胞分裂后,该染色体发生分离,形成一个新的转化子。 在大肠杆菌的重组质粒DNA分子,而非采取自然转化的方法,通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞,然后进行转化处理,其中代表性的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。(1) Ca2+诱导大肠杆菌转化法 制备感受态细胞 DNA分子转化感受态细胞 由于转化处理过程中,可能感染杂菌,导致假阳性转化子的出现,因此转化过程中须设以下几种对照处理: n DNA对照处理n 感受态细胞对照处理n 感受态细胞有效性对照处理(2)电穿孔转化法 其基本原理是利用高压电脉冲作用,在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electro poration),形

11、成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响。 一般电穿法孔转化法须在低温下(04)进行,转化效率要比在室温下操作提高约100倍。由于细菌细胞相对较小,因此与DNA导入真核细胞相对比,大肠杆菌的电转化要求有更高的场强,而反应体积则相对较小,以2040ul为宜。(3)三亲本杂交接合转化大肠杆菌 三亲本杂交(tri-parental mating)接合转化法,简称为三亲本杂交转移法,是基于非接合型质粒的迁移作用(mobilization)而建立的一种DNA转化方式,尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法的等进行重组

12、质粒DNA分子直接转化的受体菌。 如果在宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒,也称为辅助质粒,非接合型质粒通常也会被转移,这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。(4)转化率的计算及其影响因素 转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率,有两种表示方式:其一:以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示;其二:经转化子数与用于转化处理的受体细胞的比率表示。 50 ng重组DNA(10kb)转化大肠杆菌JM101后共获105 个阳性克隆子,计算其转化率 (1bp = 660 Dal)。 计算用于转化处理的DNA分子数1bp = 660 Dal 1 kb

13、DNA= 6.6 105 Dal10 kb DNA = 6.6 106 Dal(1mol 10kbDNA的质量为6.6 106g)50 ng DNA(10 kb) 所含的分子数:(50 10-9)(6.6 106) (6.023 1023 )= 45.6 10 8 转化率 = ( 1 105 ) ( 45.6 10 8)= 2.19 10 -5不同的重组DNA分子对同一受体菌细胞进行转化的效率是不一样的。 同一重组质粒DNA分子转化不同的受体菌细胞,有着不同的转化率。在上述三种转化方法中,转化率为:电穿孔法: 10 8 10 10Ca2+诱导转化法: 10 7 10 8三亲本杂交接合转移: 1

14、0 4 10 5二、重组噬菌本DNA分子转导大肠杆菌v 采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法,将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程,称为转染(transfection)。 完整、未经任何基因操作处理的噬菌体DNA的转染率仅为10 5 10 6 ;而经酶切、酶连等操作处理后的重组噬菌体DNA的转染率只有10 3 10 4。v 将重组噬菌本DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法为转导操作。转导(transduction)是指通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的主要途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。要以噬菌体颗粒感染受体细胞,必须将重组噬菌本DNA分子进行体外包装。体外包装,

15、是指在体外模拟噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反过程,将重组噬菌体DNA分子包装成为成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。主要过程有:制备包装物体外包装三、受体细胞的选择野生型大肠杆菌具有限制与修饰系统、可能存在潜在的致病性,不是理想的受体细胞。必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造,以获得适宜作为受体细胞的突变菌株,通常从以下几个方面加以考虑: 限制与修饰系统限制与修饰系统是维持野生型细菌种属特异性的保护系统,其限制与修饰作用分别由限制性核酸内切酶和修饰甲基化酶来完成。(应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞) 重组系统。在野生型细菌中,进入细胞的外源D

16、NA分子能自发地与染色体DNA发生体内同源重组反应,该重组反应由rec基因家族的编码产物所控制。因此受体细胞必须选择体内同源缺陷型的遗传表型。 易于转化或转导。可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性,从而提高其转化效率。 有明显的选择性差异。遗传表型差异大,可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。 感染寄生缺陷型。相当多的细菌对其他生物(尤其是人和牲畜)具有感染和寄生效应,重组DNA分子导入这些细菌受体后,极有可能随受体菌的感染寄生作用,进入生物体内,并广泛传播,如果外源基因对人体和牲畜有害,则会导致一场灾难,因此从安全的角度考虑,受体细胞不能具有感染寄生性。 常见的

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