《浅析细菌内毒素检测方法及常见问题》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅析细菌内毒素检测方法及常见问题（43页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题内 容v细菌内毒素简介v细菌内毒素检测方法v常见问题及解决方案一、细 菌 内 毒 素 简 介v主要内容 来源 特性 与热源的关系 在药检中应用v主要来源主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖 ，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径 约在1 5纳米 。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中 含内毒素的量为1至100EU/ml。v主要特性（实验器材处理方法） 1.耐热性一般在100加热1小时无影响，120加热4 小时能破坏98，180200干热2小时或 250干热半小时才能完全破坏。故：注射剂的一般灭菌条件
2、是不能破坏内毒素的。2.不耐酸碱性内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡v主要特性（实验器材处理方法）3.水溶性与不挥发性热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。故：不可用湿热灭菌法处理实验器具v主要特性（去除内毒素方法）4.滤过性原体积很小，约在15 nm之间，故能通过除菌 滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能 通过半透膜。5.吸附性能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。v热原=内毒素 ？热热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅仅仅 是细细菌内毒素。但在药检
3、药检 的范畴，细细菌内毒素是主要的热热 原物质质，可以说说无内毒素就无热热原，控制内毒 素就是控制热热原。v热原检查方法简介中国药典热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规 定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试 品中所含热原的限度是否符合规定。热原检查法v与热源对比内毒素检查法优势v方便、快捷、经济；v重现性好、灵敏度高；v避免抗原的产生，克服生物测定的误差；近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法v在药检中的应用细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。v成品检查药品安全性检查之一v半成品（生产过程
4、）检查事前质控手段，避 免造成药品成批报废二、细菌内毒素检测方法v中国药典批准使用方法：v供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。v本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。测定 方法凝胶法 光度测定法 浊度法 显色基质法 鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化的C因子凝胶B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鲎凝血系统酶联反应名词解释1鲎及鲎试剂鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，
5、能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。名词解释2国家标准品及工作标准品国家标准品： （单位：EU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的 效价；工作标准品：经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；名词解释3细菌内毒素检查用水凝胶法：内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；故：灭菌注射用水细菌内毒素检查用水光度法：内毒素含量应小于0.005EU/ml；细菌内毒素检测之凝胶法v实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎
6、试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测v实验材料及用具 1、仪器名称要求 天平感量0.1mg以下 电热干燥箱300 恒温水浴箱371 水银或酒精温度计100 1 漩涡混合器/ 计时器60min1min 2、器具 器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径1075mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜、记号笔v试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75乙醇v常用英文缩写 BET：细菌内毒
7、素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值v灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信 。 试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；待测鲎试剂灵敏度0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75酒精擦拭后启开 ，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀 15min后进行
8、稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.6ml0.2ml1.8ml1ml1ml1ml1ml 1ml 1ml1ml 1ml0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml水水溶解后的标准品水水水水90 EU/ml10 EU/ml1 EU/ml0.5 EU/ml0.25 EU/ml0.125 EU/ml0.0625 EU/ml（2 ）（ ）（0.5 ） （0.25 ）2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入 0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于
9、0.1ml，则取若干支， 按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管 （10mm75mm），将试管按如下形状排列。 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml ，第五列加入BET水0.1ml。1 22 3 0.54 0.25BET水22220.50.50.50.50.250.250.250.25v反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动 混匀，置37 水浴中保温602min，将每管拿出缓 缓倒转180，凝胶不变形为“”，凝胶不能保持 完整为“”。当2.0四支管都为阳性，0.25四支管都为阴性时， 试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度c ：clg-1(
10、X/4) （X:反应终点浓度的对数值。）当0. 5c 2.0时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测 时仍以标示灵敏度为准。左侧管旋转180凝胶不能保持完整为阴性，记为“”；右侧管旋转180凝 胶不变形为阳性，记为“”。举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度为0.125EU/ml:平行 管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终 点浓度CX (lgC)0.250.1250.060.03 1+-0.06-1.22 2+-0.125-0.903 3+-/0.125-0.903 4+-/0.125-0.903clg-1(X/4)lg-1（-1.22）（-0.903）（ -1.22 ）（ -1.22 ）/40.
11、104（EU/ml）c在0. 52.0范围内，符合规定。v方法学验证供试品干扰预试验 目的：确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。影响因素：新药检查方法建立；鲎试剂批号或来源的改变；检品生产工艺，配方，成分的改变；检品关键成分来源的改变；方法学验证供试品干扰预试验v供试品溶液的最大稀释倍数的计算MVDCL/ L:供试品的内毒素限值；C：供试品溶液的浓度；当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或 EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以 EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度
12、，就是1)。方法学验证供试品干扰预试验v内毒素限值(L)的确定 药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采 用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为 按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的 不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热 阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途 径的K值都有具体的规定。M为按规定的给药途径 ，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值 的确定实际上才是计算限值的关键。方法学验证供试品干扰预试验（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委 员会编制的临床用药须知来确定最大剂量。 如 儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为 准。 （2）为
13、保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗 心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药 品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2 或1/3。v方法学验证供试品干扰试验目的：验证预干扰中确定的浓度或倍数下的供 试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。试验方法：须选择两家以上的鲎试剂进行试验编编号内毒素浓浓度/配 制内毒素的 溶液稀释释 用液稀释释 倍数所含内毒 素的浓浓度平行 管数A无/供试试品溶液2 B2/供试试品溶液供试试品溶液1 2 4 82 1 0.5 0.254 4 4 4 C2/检查检查 用水检查检查 用水1 2 4 82 1 0.5 0.254 4 4 4 D无/检查检查
14、用水2v方法学验证供试品干扰试验 结果判定：如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（c） 均在0.5-2.0范围内时，则认为供试品在该浓度下不干 扰试验，否则需要对供试品做适当处理。 干扰的排除：对供试品进行更大倍数的稀释；选择灵敏度更高的鲎试剂；其他适宜的方法如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。 v供试品细菌内毒素凝胶法检测检测方法： 结果判定阴性阳性阳性阴性编编号内毒素浓浓度/配制内毒素的 溶液平行管数 A无/供试试品溶液2 B2/供试试品溶液2 C2/检查检查 用水2 D无/检查检查 用水2 注：A 无干扰浓度供试品溶液；B 供试品阳性对照；C 阳性对照；D 阴性对照。三、常见问题
15、及解决方案 1、实验前未复核鲎试剂产品的灵敏度鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验 结果，因此实验前应复核鲎试剂产品的灵敏2、实验器具的洁净度不符合要求一般用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗干净，再用新 鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（250）恒温1h即可。 实验用的玻璃器具必须严格无菌无热原，建议不要使 用一次性塑料制品。3、实验条件达不到要求实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。4、温度不符合要求实验室温度为252较好，恒温水浴箱温度为 371为宜。5、忽视样品本身干扰 供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原 则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。(1).供试品稀释法MVD=CL / 鲎试剂灵敏度()越高(数值越小)，供试品的稀释 倍数越大，干扰越小。(2).物理方法如加热法(血液制品)、冷析法(甘露醇 )(3).化学方法如调节PH值(奎诺酮类)、调节金属离子(血液保养 液、FDP)(4).生物方法如抗增液的使用，阻断G因子反应，防止假阳性；(5).其它方法如过滤法、溶剂抽提等 6、鲎试剂浓度达不到要求开启内毒素标准品和鲎试剂时
