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1、MicroRNA-224 promotes tumor progression in nonsmall cell lung cancer汇报人：李婷MiR-224促进非小细胞肺癌肿瘤形成目录 ContentsOthersMethods ResultsDiscussion在全世界，肺癌是癌症相关性疾病中主要的致病因 。尽管手术及药物治疗水平有所提高，肺癌患者的生存 率依然极低。总体来说，分期较早的非小细胞肺癌患者 ，无论是手术还是非手术患者均得到了控制。然而，非 小细胞肺癌导致局部及远处转移的分子机制尚不清楚。 在非小细胞肺癌组织中，我们证实了microRNA- 224 (miR-224) 显著
2、上调，尤其发生转移的组织中。增 加miR-224 表达水平，其通过以抑癌物质TNF- induced protein 1 (TNFAIP1) （肿瘤坏死因子介导蛋 白1）及SMAD4为靶点，从而促进了细胞的迁移，侵袭 及增殖。与体外实验一致，裸鼠异体移植实验也证实了 miR-224 在体内非小细胞肺癌中作为强力致癌的miRNA 。同时，我们还发现了在非小细胞肺癌中，启动子甲基 化及ERK信号参与调节miR-224的表达。上调的 miR- 224通过拮抗SMAD4及SMAD4 的抑制作用，从而增强 非小细胞肺癌的形成及肿瘤侵袭性。全基因组 miRNA测序miR-224在ADC及SCC 中miR-
3、224 明显 上调体内体外相关分析 细胞转染 过表达及 下调系统细胞系裸鼠miR-224在肺 癌中的作用寻找 作用靶点TNFAIP1及 SMAD4的3-UTRs共转染3- UTRs及 miRNA 转染细胞 相关分析TNFAIP1及 SMAD4是否为 特异性靶点TNFAIP1及SMAD4 与miR-224相关性 及作用miR-224以TNFAIP1 及 SMAD4的3端为作用靶点低甲基化探针相关分析miR-224与 启动子甲基 化的关系相关分析及 细胞系 佛脂醇治疗启动子低甲基化及 激活的ERK信号通路 介导miR-224的表达非小细胞肺癌 NSCLC （nonsmall cell Lung c
4、ancer）非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比 其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所 有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低 。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA，其大小长约2025个核苷酸通过碱基互补配对的方式识别靶 mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻 遏靶mRNA的翻译，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防 御、器官形成、细胞增殖和凋亡等。TNFAIP1（TNF-induced protein1）肿瘤坏死因子-（Tumor Nec
5、rosis Factor，简写TNF） 是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细 胞因子。而肿瘤坏死因子介导蛋白1涉及DNA合成及凋亡. SMAD4Smads家族蛋白在将TGF-(转化生长因子)信号从细胞表面 受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用。按功能分为3类：即 受体活化型或通路限制性Smad(RSmads)、共同通路型Smad(Co Smad)和抑制性Smad(ISmads)。miR-224上调在非小细胞肺癌中的功能全基因组miRNA测序倍数变化的miRNA miR-224技术路线俄亥俄州立大学 综合癌症中心癌症和肿瘤基因图谱miR-224 在ADC及 SCC中的 表达原位
6、分 子杂交在有转移的 肺癌中miR- 224的表达生存分析miR-224与 肺癌患者的 预后肺癌中 miR-224的 表达水平 及是否与 转移有关转染细胞统计细胞的 迁移、侵袭 及增殖能力过表达及 降低系统miR-224在肺 癌中的作用体外转染细胞皮下注射 至裸鼠过表达及 降低系统miR-224在肺 癌中的作用观察肿瘤体积 及镜下改变体内4例伴淋巴结转移的肺腺癌 6例不伴淋巴结转移的肺腺癌genome-wide miRNA sequencing87例NSCLC48例NAT(正常)在ADC及SCC中，miR-224 明显上调Ohio State University Comprehensive
7、Cancer Center (OSUCCC) 俄亥俄州立大学综合癌症中心666例ADC及SCC86例NAT相较于NATs，miR-224在ADC及SCC中明 显上调Of the evaluable 468 primary lung ADC patients, 46 patients had matched normal adjacent tissues. Of the evaluable 198 primary lung squamous carcinoma patients, 40 patients had matched normal adjacent tissues. The Cance
8、r Genome Atlas (TCGA) 癌症和肿瘤基因图谱明确分期 281例ADC N0 143例ADC N1+伴淋巴结转移的患者中，miR-224 明显上调miR-224 expression in 281 N0 patients versus 143 N1+ patients from TCGA lung ADC datasetNSCLC NATsmiR-224 在61% 的 病例中过表达51例 配对原位分子杂交在有转移的肺癌中，miR-224表达更强 miR-224可能在有转移的肺癌中起到重要作用Summary of tissue micro array data for lung
9、cancer and corresponding normal tissue. Paired analysis represents subtraction of NAT staining score from matched lung cancer tissue scores.miR-224表达与生存之间并无 明显联系642例 NSCLCKaplanMeier 生存分析TCGAmiR-224与有(kras)/p53 突变肺腺 癌患者的不良预后明显相关59例 ADCKaplanMeier 生存分析同样地在有(kras)/p53 突变肺腺癌患者中，相较N0组，可观察到N1+ 组 的miR- 22
10、4 expression表达上调，miR-224 expression in 31 N0 patients versus 26 N1+ patients from lung ADC patients who have TP53 and/or KRAS mutations. H 1299 H 1573 H 460miR-224过表达 转染含miR-224前体的Lenti-miR 载体A 549miR-224下调转染含miRZip-224 antimiR-224 结构 的载体RT-PCRH1299 H1573miR-224 过表达H1299 and H1573细胞的迁移，侵袭 及增殖明显增加Cel
11、l migration assay for miR-224overexpressing H1299 andH1573 cells using transwell membranesCell invasion assay for miR-224 overexpressing H1299 and H1573 cellsCell proliferation assay for miR-224overexpressing lung cancer cells迁移细胞计数H460Migrated cell counts after overexpressing miR-224 in H460 Migrat
12、ed cell counts after knockdown miR-224 in A549 cells Migrated cell counts after overexpressing miR-224 in H1299 (e), H1573 (f),H1299及H1573A549migration assay for miR-224 knockdown A549 cellsCell proliferation assay for miR- 224 knockdown A549 cellsMigrated cell counts after knockdown miR-224 in A549
13、 cells.H460/miR-224对照组细胞系或 A549/miRZip224皮下注射至裸鼠侧面相较于对照组细胞， 过表达 miR-224 的H460细胞系 显著 增加了体内的肿瘤增长下调A549 细胞中 的miR-224皮下注射至裸鼠侧面肿瘤体积减少在肺癌中miR-224作为致癌 miRNA . 镜下miR-224以TNFAIP1 及 SMAD4的3端为靶点技术路线生物信息分析TNFAIP1及 SMAD4的3-UTRs寻找靶点共转染3- UTRs及 miRNA 是否为靶点免疫荧光共转染突变 3-UTRs及 miRNA 靶点特 异性免疫荧光TNFAIP1及 SMAD4是 否为特异 性靶点过
14、表达 及降低 系统miR-224 对靶蛋白 的影响OSUTCGA 数据库检测TNFAIP1 及SMAD4表达相关分析TNFAIP1及SMAD4 与miR-224相关性转染 细胞miR-224的促癌作用是否由于与靶基因 TNFAIP1及SMAD4结合并降低抑癌作用过表达及 降低系统转染SMAD4 至过表达miR -224细胞评估SMAD4 作用TGF-治疗miR-224是否通过以SMAD4为 靶点而影响TGF-信号通路3-UTRs的荧光信号持续性减低3-UTRs miR-224 mimics293T cells共转染miR-224 3-UTRs的突变形式野生型 3-UTRs的荧光信号持续性减低的
15、 趋势减弱野生型的及 突变的 TNFAIP1 and SMAD4 3-UTRs 与with miR-224 mimic 共转染至 293T 细胞miRNA and 3-UTRs靶点的特异性.在H1299, H1573, 和 H460细胞系中， mRNA and 蛋白质的TNFAIP1 and SMAD4 表达 减少过表达 miR-224Western blot and quantitative RT-PCR 检测转 染了表达 miR-224前体的及 对照载体的肺癌胞中， TNFAIP1 及 SMAD4 蛋白及 mRNA 水平在 A549 细胞中，TNFAIP1 及 SMAD4 mRNA蛋 白质
16、水平表达增加下调miR-224Western blot and quantitative RT-PCR 检测转染了表达 下调miR-224的及对照载体的肺癌胞中， TNFAIP1 及 SMAD4 蛋白及 mRNA 水平检测miR-224 对 靶蛋白及靶 mRNA的影响TNFAIP1 (P = 4.9E-15) and SMAD4 (P = 2.2E-16) 表达显著降低TNFAIP1和 SMAD4 表达降 低原发性肺鳞癌 组织, TNFAIP1 和SMAD4 减少.334ADC &57NATs349SSC &51NATs TCGA datasetNSCLC中TNFAIP1 (5.23E-14) and SMAD4 (2.67E-06)的表达下降TNFAIP1 and SMAD4 expressions in 63 NSCLC patients with 48 matched NATs from OSU cohort63例NSCLC &48 NATs 111例NSCLC OSU306例NSCLC TGGAPearson 相关分析
