基因组序列诠释20111024

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1、基因组学 辽宁师范大学生命科学学院辽宁师范大学生命科学学院 张剑锋张剑锋第5章 基因组序列诠释完成基因组测序仅仅是基因组计划的第一步，更大 的挑战在于弄清：基因组顺序中所包含的全部遗传信息是什么？基因组作为一个整体如何行使其功能？这两项任务都必须依赖于对基因组顺序的正确注解 或诠释(annotation)，首先是从已知顺序中搜寻基因 。 5.1 搜寻基因 n一旦获取基因组的DNA顺序后，不管它是来自某一 区段还是一整条染色体，第一个任务就是从中查找 基因，这是解读整个基因组的基础。查找基因有两 种常见的方法：n根据已知的顺序人工判读或计算机分析寻找与基 因有关的序列；n进行实验研究，看其能否表

2、达基因产物及其对表 型的影响。 5.1.1 根据顺序分析搜寻基因n如果一段DNA顺序中含有编码基因，那么这 段顺序的碱基序列就不会是随机排列的，一 定存在某些可以辨别的特征。目前还没有一 个能适用于所有情况的“基因序列”的标准， 只能根据已知的某些规律来推测哪些顺序可 能是基因。 开放读框 n基因都含有开放读读框(open reading frames，ORFs)，它们们 由一系列指令氨基酸的密码码子(codons)组组成。开放读读框有一 个起点，又称起译译密码码(initiation codon)：ATG；还还有一个 终终点，又称终终止密码码(termination codon)：TAA、T

3、AG和 TGA。从DNA顺顺序中搜寻寻基因总总是从第一个ATG开始，然 后向下游寻寻找终终止密码码。在开始这项这项 工作之前，我们们并不 知道DNA双链链中哪一条单链单链 是编码链编码链 ，或称正(+)链链，也 不知道准确的转译转译 起始点在何处处。由于每条链链都有三种可 能的读读框，两条链链共计计6种读读框，计计算机可以很快给给出结结 果。nORF扫扫描的关键键是终终止密码码在6种读读框中出现现的频频率。如 果DNA的碱基排列是随机的，并且GC含量为为50%，则则三个 终终止密码码子：TAA、TAG和TGA出现现的平均机率为为每43= 64bp一次。假如GC比大于50%，因终终止密码码中AT

4、比例高 ，则则每隔100-200bp才会出现现一个终终止密码码。随机碱基排列 的ORF长长度预计预计 不超过过50个密码码子，即150bp，以ATG起 始计计算长长度更短。大多数基因的ORF均多于50个密码码子， 因此最可能的选择应该选择应该 是ORF不少于100个密码码子的读读框 。 n细菌基因组中缺少内含子，非编码序列仅占11%， 对读框的排查干扰较少。假定基因之间不存在重叠 顺序，也无基因内基因(gene-within-gene)，那么 ORF阅读出现差错的最大可能性只会发生在非编码 区。细菌基因组的ORF阅读相对比较简单，错误的 机率较少。n高等真核生物DNA的ORF阅读比较复杂，其原

5、因在 于：基因间存在大量非编码序列(人类基因组中占70%) ；绝大多数基因含有非编码的内含子。高等真核生 物多数外显子的长度少于100个密码子，有些不到50 个密码子甚至更少，因此当读码进入内含子时很快 遇上终止密码，难以根据上述的ORF长度来判断哪 种读框是正确的。 n内含子的出现给计算机判读基因带来不少问题，在编写ORF扫描 程序时要作许多修改，必须加入一些相应的规则：n密码子偏爱 生物具有通用的64种密码子，其中三种为终止密 码子，其余61种密码子编码20种氨基酸，除甲硫氨酸(Met)和色 氨酸(Trp)各有1个密码子外，其他氨基酸都拥有多个密码子。编 码同一氨基酸的不同密码子称为同义密

6、码(synonym)，其差别仅 在密码子的第三位碱基不同。不同种属之间使用同义密码的频率 有很大差异，如人类基因中，丙氨酸(Ale)密码子多为GCA， GCC或GCT，而GCG很少使用。苏氨酸(Thr)常用的密码子为 ACA，ACC或ACT，很少用ACG。高等植物207个基因的编码顺 序，其中单子叶植物基因53个，双子叶植物基因154个，分属6个 单子叶和35个双子叶种群。单子叶与双子叶主群密码子(majority codon)中第三个摇摆碱基的成员比例明显不同。单子叶18种氨基 酸中有16种氨基酸的密码子摇摆碱基为G+C，而双子叶中仅有7 种氨基酸的密码子摇摆碱基为G+C，或者说双子叶密码子

7、摇摆碱 基大多为A+T。这一现象称为密码子偏爱(codon bias)，其产生的 原因不明。特定种属有特征性的密码子偏爱，这些序列在编码区 常常出现，非编码区只保持平均的碱基分布水平。根据已有生物 密码子偏爱的资科在编写相应的计算机程序时可加入这些限制。n外显子-内含子边界(exon-intron boundaries) 外显子与内含子 的边界区有一些明显的特征，如内含子的5端或称供体位(donor site)常见的顺序为5-AGGTAAGT-3，3端又称受体位(acceptor site)多为5-PyPyPyPyPyPyCAG -3(“Py”为嘧啶核苷酸，T或C) 。这是判断编码顺序的依据之

8、一。由于外显子-内含子边界顺序 常有例外，编写通用的判读程序时有不少困难，上述规律仅适用 一定范围。n上游控制顺序(upstream control sequence) 几乎所有的基因(或 操纵子)上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用控制基 因表达。调控顺序有明显特点，在查找基因时可作为参考，特别 是原核生物。真核生物基因上游的控制顺序变化较大，以此作为 标志判别基因时应当谨慎。n上述这三种ORF扫描的方法适合所有高等真核生物基因组，可综 合运用。还有一种针对个别生物的策略，主要依据这些生物基因 组特有的组成。例如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛 (islands)。CpG岛的

9、长度约1kb，其CG比例显著高于基因组平均 水平。约56%的人类基因与上游的CpG岛相连，在基因组顺序扫 描时，如发现CpG岛有可能在其下游找到基因。 同源查询 n利用已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较 ，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例用于界定基因的方 法称为同源查询(homology search)，它可弥补ORF扫描的不足 。同源查询的依据是，现有生物的不同种属之间具有功能或结 构相似的直系基因成员，它们在起源上一脉相承，其间存在保 守的顺序组成。同一物种中因基因重复产生的基因家族也有保 守的序列特征。当某一DNA顺序含有这类基因时，通过与已报 道的其他基因序列对比，

10、可发现其中的相似性。这些相似性有 以下表现：n 存在某些完全相同的序列；n ORF读框的排列类似，如等长的外显子；n ORF指令的氨基酸顺序相同；n 模拟的多肽高级结构相似。n以上这些结果均可作为基因界定的指标，它们可单独使用，亦 可综合考察。同源查询还可提供基因功能的参考，目前这一技 术已成为界定基因的主要工具之一。当某一顺序从数据库中无 法找到同源序列，又无法排除其不是基因的可能性时，必须依 靠实验来进一步确认。在基因分类时这些缺少同源顺序的ORF 被称为孤独基因(orphan gene)。 5.1.2 实验分析确认基因 n任何基因都可转录为RNA拷贝，这是实验确证基因 的依据。真核生物中

11、许多编码蛋白质的基因其转录 的初级产物都有内含子，加工后成为mRNA。根据 mRNA的顺序可以找到外显子的位置以及整个基因 的组成。由于mRNA的5端及3端各有一段非翻译区 ，基因的转录起点与终点有时并不准确，但不妨碍 整个基因的界定。 分子杂交可确定DNA片段是否含表达顺序 n进行分子杂交实验时，样品中纯化的RNA经电泳分离， 然后转移到杂交膜上，这一过程称为northern印迹 (northern blotting)。将待测DNA样品标记后与RNA杂 交，如果RNA中含有DNA的转录产物，会给出明显的 信号。northern印迹分析要注意以下三方面：n 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，

12、由于连接 的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带。此外 ，如果该基因是某一多基因家族的成员，也会出现多个 信号。这两种现象要设计其他实验进一步区分。n 基因的表达具有组织专一性及发育阶段的差别，选 择的RNA样品有时不一定含有该基因的产物。因此要尽 可能多地收集各种发育时期及不同组织器官RNA，以免 因人为原因而遗漏。n 不同基因的表达产物丰度差异很大，对低拷贝的 表达产物要适当提高RNA的上样量。有些基因表达 产物丰度极低，或表达时期短暂不易提取，此时要考 虑其他检测方法。例如可根据已知的DNA顺序设计 引物从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探 针与之杂交，这一方法称为拟nort

13、hern分析。n对northern杂交不易检测到的基因可考虑采用另一种 途径验证。一些亲缘关系相近的物种，其基因的编码 区相似性较高，而非编码区的同源性很低。如果某一 物种的DNA顺序与来自另一亲缘种的DNA片段杂交 产生阳性信号，该区段可能含有一个或多个基因。这 种方法又称为动物园杂交(zoo-blotting)。 DNA顺序中基因位置的确定 nnorthern分析和动物园杂交可判断某一DNA区段 是否含有基因，但不能给出基因在DNA顺序中的 确切位置。cDNA的测序可以解决这一问题。将 cDNA与基因组的DNA比较，即可确定基因所在 的区域并找到外显子-内含子的边界。两种因素 会干扰用cD

14、NA筛选基因的工作：n 当目标cDNA克隆在cDNA文库中所占比例很低时，需要 化费大量时间从很大的cDNA群体中筛选阳性克隆。有两种 可提高工作效率的方法，其一，将cDNA文库先分成若干亚 群，对这些经“稀释”过的亚群进行初筛。由于各亚群中稀有 cDNA的比例有差别，可挑选杂交信号强的亚群进一步筛选 。其二，cDNA均一化(cDNA normalization)，是缩小低拷 贝cDNA与高拷贝cDNA在cDNA文库中比例差异的方法，通 过抑制高拷贝cDNA数量，增加低拷贝cDNA达到均一化的 目的。cDNA均一化的基本原理是DNA复性动力学。DNA复 性的速率取决于以下因素，即碱基组成、DN

15、A克分子浓度 和反应温度。在合适的条件下，可使大多数高拷贝cDNA复 性成为双链，但仍然有少量高拷贝单链cDNA保持游离状态 ，而大部分低拷贝与中拷贝单链cDNA均呈游离状态。将反 应液通过羟基磷灰石层析柱，双链cDNA被羟基磷灰石吸附 ，收集过柱的单链cDNA用于构建cDNA文库。经均一化后 ，高拷贝cDNA的比例可降低一个数量级，而低拷贝cDNA 可提高一个数量级。n 与mRNA反转录有关。mRNA分子的5-端或其他 区域有时会产生二级结构，当反转录酶以RNA为模 板合成单链DNA时，如遇上RNA二级结构便会终止 反应，从而产生残缺的cDNA。高温下合成cDNA的 反转录酶可降低mRNA二

16、级结构的干扰，获得全长 的cDNA。另一种确保合成5完整cDNA的方法是， 根据反转录单链cDNA 3-末端有一个额外的C碱基， 可设计一种 5-端含几个连续G的引物，将其加入反 应液中。反转录酶合成的单链cDNA 3-末端可与该 引物互补，使cDNA 3-末端延伸。收集合成的全长 单链cDNA，再用设计的引物扩增单链cDNA用于全 长cDNA文库的构建。采用RACE方法可获得丢失的cDNA末端 n由于一些未知的原因，cDNA文库中有些插入子会丢 失其5-或3-端顺序，可采用cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA end，RACE)方法寻找 这些丢失的末端顺序。根据残缺cDNA内部顺序先合 成一对引物，将mRNA环化后使其与引物复性，再经 PCR扩增。扩增产物再用第二对巢式引物PCR放大， 可获得mRNA 5-和3-端顺序。 5.2 基因功能预测 n确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题是探知其 功能，这是基因组研究中的一个难度很大的领域。一 些已