环境工程微生物学污染物的生物效应检测

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1、第三章 污染物的生物效应检测本章将讨论以下内容生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法3.1 生物测试及方式生物测试（Bioassay）的概念： 指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素 单独或联合存在时所导致的影响或危害。 注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个 体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。 注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测 定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度 。 例如：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因 素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及

2、不利的浓 度或强度；污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染 物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放 浓度等。生物测试的方式短期生物测试（Short Term Bioassays） 主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性 ，评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不 同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。多数采用静 止式。 中期生物测试（Intermediate Term Bioassays） 时间为8d到90d，多数情况下为流动式。 长期生物测试（Long Term Bioassays） 包括全部生活史的生物测试（Complete L

3、ifecycle Bioassays ）和部分生活史的生物测试（ Partial Lifecycle Bioassays ） 目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓 度或最大允许毒物浓度（MATC） 只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变 化相符合。受试生物的选择影响生物测试结果的因素 受试生物 试验条件 实验室差异生物测试的标准化3.2 一般毒性试验基本概念 毒物（Toxicant）的概念 毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达 到中毒剂量时才是毒物。 中毒（Intoxication） 中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中 毒、慢性中

4、毒。 毒性（Toxicity） 指一种物质引起机体损伤的能力。 毒性作用或毒效应（Toxic Effect）效应（Effect） 也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产 生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变 可用一定的计量单位表示。反应（Response） 指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一 定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体 而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡 率等。剂量效应关系和剂量反应关系 以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表 示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到 的曲线，即为剂量效应关系和剂量反应关系曲 线。 不同的化学物或同

5、一化学物在不同条件下，其剂量 与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的 曲线。（见图）剂量效应关系和剂量反应关系曲线图剂量10050反应强度（）图31剂量反应曲线（直线型 ）剂量10050死亡率（）图32 剂量反应曲线（抛物线型 ）对数剂量10050死亡率（）图33 剂量反应曲线（S形线型 ）死亡率（概率单位 ）对数剂量10050图34 剂量反应曲线毒性试验常用参数致死剂量或致死浓度（Lethal Dose， Lethal Concentration） 绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100） 半数致死剂量或浓度（LD50、LC50） 最小致死剂量或浓度（MLD、MLC） 最大耐受

6、剂量或浓度（LD0、LC0 ） 最大无作用剂量（Maximum Noeffect Level ） 化学物在一定时间内，按一定方式与机体接触，按 一定的检测方式或观察指标，不能观察到任何损害 作用的最高剂量。 每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake） 最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）最小有作用剂量化学物能使机体发生某种异常变化所需最小剂量，即能 使机体开始出现毒性反应的最低剂量，又称中毒阈剂量 。毒作用带 急性毒作用带=半数致死量/急性毒性最小有作用剂量 慢性毒作用带=急性毒性最小有作用剂量/慢性毒性最 小有作用剂量半数效应浓

7、度（EC50）和半数抑制浓度（IC50）急性毒性试验（Acute Toxicity Test）急性毒性试验（Acute Toxicity Test） 研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒 动物所引起的毒性的试验。 其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并 为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。急性毒性试验类型 哺乳动物急性毒性试验 水生生物急性毒性试验 蚯蚓急性毒性试验动物急性毒性试验（1）按试验要求选择受试生物 常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验 动物预先观察几天后标记编号并随机分组。预备试验和确定剂量组 选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90（ 或全部）死亡的剂

8、量和引起动物10死亡（或不死 亡）的剂量。 在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按 等比级数插入若干个中间剂量（一般46组），从 而确定正式试验的剂量组。染毒方式和受试物的配制 一般用灌胃法和人工熏气法。 受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液 ，然后依次稀释到所需浓度。动物急性毒性试验（2）观察指标 中毒症状：一般观察2448小时，最好观察到绝大 多数动物出现典型中毒症状。 动物死亡数目和死亡时间 病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖， 分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡 。确定半数致死量（LD50）试验结果分析 LD50值越小，毒性越大。 急性毒性试验结果只能粗

9、略地表示某化学物质的毒 性，而不能全面反映其毒性。 由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的 毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染 毒方式。亚慢性毒性试验和慢性毒性试验亚慢性毒性试验在相当于动物生命周期的1/301/20的时间内使 动物每日或反复多次接触受试物的毒性试验。慢性毒性试验以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触观察 试验动物所产生的生物学效应的毒性试验。 低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次与机体 持续接触，经一定时间后使机体呈现明显的中毒 表现，即为蓄积毒性作用。 蓄积系数法（Cumulative Coefficient Method）： 用来评价环境污染物蓄积作用

10、的方法。 蓄积系数K生物半减期T蓄积毒性试验3.3 生物的分子和细胞水平检测加合物的测定 DNA加合物的测定 蛋白加合物的测定 一般代谢酶的活性测定 乙酰胆碱酯酶 腺三磷酶 解毒系统酶类诱导作用的检测 混合功能氧化酶的诱导作用 谷胱甘肽硫转移酶 抗氧化防御系统检测 过氧化氢酶 谷胱甘肽过氧化酶3.4 生物致突变、致畸和致癌效应检测 3.4.1致突变试验致突变试验的目的 致突变试验的目的是为了检查受试物对机体遗传过 程有无影响的方法。致突变试验方法 基因突变试验，例如Ames试验，下文以鼠伤寒沙 门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法为例介绍。 染色体畸变试验 DNA损伤试验Ames试验Ames试验原理

11、 同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接 触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生 物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种 突变叫做回复突变。鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法 方法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活 化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由 不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his ），回复为能自行合成组氨酸的（his）菌落数。 突变率诱发回复突变菌落数 / 自发回复突变的菌 落数（对照） 当突变率大于2.0时，为阳性结果。染色体畸变实验试验原理利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作 用后，染色体发生数目和结构改变的情况。可在体细

12、胞，亦可在生殖细胞中进行；体内体外皆可进行。具体方法见教材微核试验微核是由染色单体或染色体的无着丝点片段或因仿锤 体受伤而失去的整个染色体，在分裂后期，仍留在细 胞质中，或因核膜受损后和物质向外突出延伸形成的 小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小而称微核。一切进行分裂的细胞，在染色体断裂剂的作用下均能 产生微核，因此可用微核率的变化来检测诱变物。3.4.2 致畸效应致畸作用的毒理学特点 胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而 呈现不同的敏感性。 种属差异较为明显。化学致畸作用机理 突变引起胚胎发育异常； 对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制； 母体正常代谢过程被破坏； 细胞分裂过程的障

13、碍致畸试验 致畸试验的目的检测环境污染物能否通过妊娠母体 引起胚胎畸形。 一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相 似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经 济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。致畸作用的评价 注意与自然变异区分； 注意种属差异； 注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差 别。3.4.3 致癌效应细胞癌变学说体细胞突变、分化障碍、癌基因癌变过程 引发阶段 促进阶段 浸润和转移阶段致癌试验 致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌 效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。 短期筛检方法 长期动物诱癌试验3.5 微宇宙法微宇宙（Microcosm） 是研究污染物在生物种群、群

14、落、生态系统和生物 圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系 统法。可分为自然微宇宙和人工微宇宙或分为水生 微宇宙和陆生微宇宙。标准化水生微宇宙 用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生 态系统的影响。 试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验生 物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。对温度 、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。烧杯水生微宇宙 试验时间1214周，容器为1L的玻璃广口瓶，试 验生物包括4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原 生动物。对温度、光照强度、pH值等理化参数均 有具体要求。 与前者不同的是通过加入来自生态系统浸出液提供 给微宇宙中生物群落所需的基质。

15、室外水生微宇宙 又称中宇宙，试验单元6 m3，试验生物包括浮游植 物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物 。土壤核心微宇宙 该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条 件控制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所 不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生 态环境的影响及其环境归趋。模拟农田生态系统 该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农 药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计， 采用0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空 气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。生物测试与常规的物理、化学检测有何不同？表示毒性的常用参数有哪些？能否解释其含义？ 何谓Ames试验？它的原理是什么？在学习了本章内容之后，请思考以下问题：