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1、植物基因的同源克隆陈桂信福建农林大学园艺学院植物基因同源克隆的原理 拟分离的基因在目标植物上没有报导 过, 然而在其它植物上有过报导，在 genebank上搜索已分离出的该基因的 核苷酸序列或氨基酸序列，通过序列 同源性比较找出该基因的保守区，并 在该保守区内设计寡核苷酸引物，通 过扩增得到目标植物该基因的 保守区片段，再通过基因组文库筛选 获得该基因的全长，或通过cDNA文库 筛选和（Rapid Amplification of cDNA ends)获得该基因的cDNA全 长。植物基因同源克隆的策略1. 植物基因组DNA的提取与纯化保守区引物设计PCR扩增基因保守区片段构建基因组文库基因文库
2、筛选基因全长的获得2. 植物总RNA的提取与纯化逆转录 cDNA 保守区引物设计PCR扩增 构建cDNA文库保守区cDNA片段设计RACE引物5/-RACE 3/-RACE cDNA文库筛选基因的cDNA全长植物基因组DNA的提取与纯化1.CTAB法:提取缓冲液为100mM Tris-HCl(pH8.0)1.4M NaCl，20mMEDTA (pH8.0)，2%（W/V）CTAB。2.SDS法：提取缓冲液为100-200mM Tris-HCl(pH8.0)，0.25- 0.5MNaCl，25-50mM EDTA(pH8.0)，0.5-2.0%（W/V）SDS（单独加）。植物DNA的提取方法植物
3、DNA提取的必经步骤1.破碎细胞壁:液氮研磨。 2.裂解细胞：CTAB（Cetyl Trimethyl Ammonium Bromige，十六烷基三甲基溴化铵)或SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基磺酸钠）裂解膜结构， EDTA螯合核酸酶中的Mg2+，65保温30-60min 钝化内源核酸酶。 3.去除多酚类、多糖等次生物质。 4.去除蛋白质：用酚、酚与氯仿（1:1）、氯仿与异戊 醇（24:1）抽提；5MKAc（pH7.5)沉淀蛋白质；蛋白 酶K水解蛋白质。 5.沉淀核酸：0.6-1.0倍体积冰冷的异丙醇；2倍体积的 无水乙醇；70%乙醇清洗沉淀中的无机离子。 6.除
4、RNA：用RNase消化；用LiCl沉淀RNA。 7.浓缩DNA：0.1倍体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙 醇沉淀。 8.溶解DNA沉淀：0.1或1TE(pH8.0）或无菌双蒸水。植物DNA提取的难点1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕 褐色。 2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。 3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和 Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶 切的失败 。多酚、多糖与其它次
5、生物质的去除1.材料的选择与处理：新鲜、幼嫩嫩芽、嫩叶、幼苗 ；叶片的饥饿处理：4黑暗处理1-2天，消耗淀粉和 多糖。在研磨后用-20预冷的丙酮抽提2次。 2.在细胞裂解之前分离细胞核（两步法）除多糖和多酚 ：研磨：破坏细胞壁，释放果胶类多糖细胞器与核膜 保持完整 加入核分离缓冲液（不含去垢剂）混 匀 低速离心去上清（多糖、酚类） 加入 含去垢剂的核裂解液。 3.调整提取缓冲液的组成除多糖和多酚：NaCl：浓度为 0.7M时，RNA与DNA溶于CTAB，而多糖不溶解，CTAB与 多糖和残留的蛋白质形成复合物，通过氯仿或酚抽提 停留在界面上，容易去除；浓度为0.4M时，核酸沉淀 。CTAB：常用
6、2.0%，多糖含量高的可提高至3.0%。pH 值：通常为8.0，低pH（5.5）能避免酚类物质的电离 和随后的氧化。4.在提取缓冲液中加入抗氧化剂除多酚：-巯基 乙醇、抗坏血酸纳、半胱氨酸、二硫苏糖醇 等提供巯基（-SH），与酚类物质竞 争氧， 防止酚氧化成醌，-巯基乙醇：常用0.1-2.0% ，酚类高的可用至5.0%。有的在提取缓冲液 中加入PPO的抑制剂如0.1%(W/V)DIECA diethyldithiocarbamic acid。 5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭：0.1 -0.3%（W/V）。6.高盐去多糖法：在氯仿/异
7、戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中； 在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。 7.CTAB/NaCl溶液（4.1%NaCl，10%CTAB） 提取与氯仿/异戊醇抽提法除多糖：将DNA样 品中的NaCl浓度调整到0.7M，加入0.1V的 CTAB/NaCl溶液，混匀后用氯仿/异戊醇抽提 ，直到白色界面（多糖与其他大分子污染物） 消失为止。8.使用糖苷水解酶：在DNA的粗提液中同时加入 RNase和糖苷水解酶（如caylase M3），在去 除RNA的同时，也除去果胶
8、类多糖。 9.柱层析法除多糖：RPC-5反向柱层析； Syphacryl S-1000柱层析，结合PEG8000沉淀 DNA相结合。 10.稀释DNA样品：2ng DNA模板/反应。 11.CsCl（氯化铯）梯度离心。植物总RNA的提取植物总RNA提取的必经步骤1.破碎植物组织细胞。 2.核蛋白变性释放出RNA。 3.抑制内外源RNase的活性。 4.将RNA、DNA、蛋白质及其它细胞物质分 开。植物总RNA提取的常见方法1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和 -巯基乙 醇变性蛋白质并抑制RNase活性，经过 多次酚/ 氯仿抽提后，再沉淀RNA。2.苯酚法：用SDS变性蛋白并并抑制RNase活 性
9、，经过 多次酚/氯仿抽提去除蛋白、多糖、色 素等杂质 后，再用NaAc和乙醇沉淀RNA。3.LiCl沉淀法：0.8MLiCl会特异沉淀RNA。4.CTAB法。植物总RNA提取的难点1.内外源RNase的污染。2.多酚类物质的干扰3.蛋白质的干扰4.多糖的干扰创造一个无RNase的环境1.器械的消毒：用0.1%DEPC二乙基焦碳酸盐 （Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上， 然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250） 干热消毒4hr以上或200干热消毒过夜。 2.溶液的消毒：除Tris-HCl外，所有溶液应加 DEPC至终浓度为0.05-0.1%，处理过夜后高压 灭菌
10、。 3.整个操作过程应在超净工作台上进行，且应 戴手套操作。 4.所有操作应在冰上进行。植物总RNA提取过程中主要试剂的作用1.DEPC：与RNase的组氨酸结合，使蛋白质变 性。与0.1-1mg/ml肝素联合使用，具有极强的 RNase抑制效果。它在Tris中易分解形成CO2 和乙醇，使pH值下降。 2.阴离子去垢剂：SDS，Sarkosyl，脱氧胆酸钠 （DOC）解聚核酸与蛋白质的结合，在高浓 度钾离子存在时，形成SDS-蛋白质的复合物 沉淀。 3.胍盐、-巯基乙醇：是解偶剂，破坏蛋白质的 二硫键。 4.RNasin：是RNase的一种非竞争性抑制剂，不 能与7.0M尿素混合使用。5.氧钒
11、核糖核苷复合物：与RNase结合形成过渡 态类似物。使用浓度为10mM。 6.酚、氯仿：使蛋白质变性。 7.多胺、蛋白酶K、共聚酪氨酸-谷氨酸：抑制 RNase的活性。 8.LiCl：RNA的选择性沉淀剂。植物总RNA提取过程中多酚类物 质干扰的排除1.在提取缓冲液中加入还原剂：-巯基乙醇、二硫苏糖 醇（DTT）、半胱氨酸、硼氢化钠（NaBH4)。过夜 沉淀RNA时加入1% -巯基乙醇。 2.研磨时加入螯合剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚 乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO-N=基在pH8.0以下 时有结合多酚的能力。 3.用-70的丙酮抽提冷冻研磨的植物材料。 4.降低提取缓冲液的pH值（5.5
12、）。 5.使用Tris-硼酸缓冲液（0.2M）。 6.在提取缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）和肝素。 7.用LiCl或CaCl2、50% 2-丁氧乙醇选择性沉淀RNA。植物总RNA提取过程中多糖干扰的排除1.低浓度乙醇沉淀多糖法：在提取缓冲液中或在 RNA水溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度为 10-30%，可以沉淀多糖，RNA留在上清液中 。一般在匀浆液中或匀浆上清液中加入终浓度 为10%的无水乙醇，在RNA的水溶液中加入终 浓度为30%的无水乙醇，以沉淀多糖。 2.醋酸钾沉淀多糖法：在匀浆液中加入1/5-1/3体 积的5M醋酸钾（pH4.8）或加入1/3体积的 8.5M醋酸钾（pH6.5）以
13、沉淀多糖；在匀浆液 中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M 醋酸钾（pH4.8）以沉淀多糖。3.调整提取缓冲液中NaCl的浓度：1.0-2.0M。4.将酚/氯仿抽提的上清液稀释使钠离子浓度为80mM ，然后加入0.4倍体积的2-丁氧乙醇沉淀多糖。植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯酚、胍、SDS、CTAB等）。3.利用蛋白酶K降解蛋白质。4.利用苯酚、氯仿抽提。5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。植物DNA和RNA的检测1.凝胶电泳：琼脂糖浓度为0.7-1.0%，胶用1TAE或 1或0.5T
14、BE电泳缓冲液配制，加入0.5g/ml溴化 乙锭（EB），平板胶厚度为3-5mm。上样缓冲液： 溴酚蓝，DNA或RNA样品：2-5l ，电压：4-5V/cm ，时间：2040min。 2.紫外吸收法：波长为260nm、280nm时的吸收值， 1OD260=50g/ml双链DNA，1OD260=40 g/ml单链DNA或RNA。单链DNA：浓度C （g/ml） = OD260 /0.027，双链DNA：浓度C （g/ml） = OD260 /0.020，单链RNA：浓度C （g/ml） = OD260 /0.025。 DNA 纯品：/OD260/OD280=1.8-1.9，RNA纯品： OD26
15、0/OD280=1.9-2.0，低于此值，说明有蛋白质或酚类污染。木奈基因组DNA粗提液电泳图木奈基因组DNA纯化电泳图木奈总RNA粗提液电泳图木奈总RNA纯化电泳图木奈果肉总RNA电泳图植物基因的同源克隆植物基因保守区片段的克隆植物基因序列同源性的比较植物基因同源序列的搜寻进入GeneBank：美国国家生物技术信息中心（national centre for biotechnology information,NCBI)，网址为www.ncbi.nim.nig.gov。NCBI的使用在search选项中选择nucleotide,在For选项中 输入所要搜寻基因的名称,按go,就可搜寻 genebank中已经克隆的基因的序号、基因 名称、注册号；双击BD085077. Polyphenol oxidas.gi:22630687 就显示 基因的全部内容，在display选项中选择 genebank。搜寻到基因的内容LOCUS BD085077 1319 bp DNA linear PAT 27-AUG-2002 DEFINITION Polyphenol oxidase genes from banana, tobacco and
