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1、核外遗传学研究进展叶绿体基因组（chloroplast genome）chloroplastchloroplastchloroplast genome叶绿体基因组研究进展vThe discovery of chloroplast DNAvThe origin of chloroplastvThe function of chloroplast genomevThe structure of chloroplast genomevGene loss in chloroplast evolutionvThe regulation of chloroplast evolutionvChloropla
2、st Genetic EngineeringThe discovery of chloroplast DNAvv19091909年，德国植物学家年，德国植物学家C.CorrensC.Correns首先报道非孟首先报道非孟 德尔遗传（紫茉莉的遗传）德尔遗传（紫茉莉的遗传） v1937年，日本学者今井提出了质体基因的概念 用来指叶绿体中的遗传因子。v上世纪50，60年代，科学家们开始时用组织化 学和放射自显影的技术对叶绿体DNA进行了直接 的研究在多种藻类和高等植物中直接发现了 DNA的存在。v至2O世纪70年代中期叶绿体中整套的遗传系统 及其非孟德尔遗传规律已被揭示。The discovery
3、of chloroplast DNAThe discovery of chloroplast DNA原因：原因：精卵结合中形成精卵结合中形成 的合子父母双亲所提供的合子父母双亲所提供 的的遗传物质不均等遗传物质不均等造成造成 的，所以正反交结果不的，所以正反交结果不 同。同。核外存在遗传物质The origin of chloroplastv内共生起源说 v间接起源说内共生起源说v一般认为，高等植物叶绿体基因由蓝细菌入侵而来 。早在1975年，Linda Bonen和Ford Doolittle就对 蓝细菌和叶绿体的T1 rRNA 的相似性进行了分析。 Hans KSssel是用最早DNA测序
4、技术对叶绿体基因 进行分析的实验者之一。他通过对玉米叶绿体rRNA 的一二级结构的研究，发现叶绿体rRNA与细菌的相 似性超出了与真核细胞的核基因的相似性，这对共 生学说是一个十分有力的证据。Flugge和Heldt发现 在叶绿体的套膜上有运送光合作用产物的载体。后 来的研究发现这些在黑暗条件下可以为叶绿体服务 ，这是对内共生的重要阐述endosymbiotic theory间接起源说v高等植物的叶绿体有两层膜，但不少藻类的叶绿体 有三四层膜。Sally Gibbs最早提出间接起源说(二次 共生假说)。v这一假说认为多膜的叶绿体并非由蓝细菌直接进化 得到，而是由含简单叶绿体的生物被吞噬而形成的
5、 。在这种情况下，被吞噬的细胞被大大地消减了 只留下叶绿体，而导致了叶绿体的多层膜的结构。v后来，人们在隐滴虫中发现了内共生体核的微量残 留，从而证实了间接起源的过程。The structure of chloroplast genomev一：大部分叶绿体DNA都是共价闭合的双链环状分 子，少数为线状分子。不同种类的植物中环状叶绿 体DNA分子所占的比例不同，如高等植物中有80 的叶绿体DNA呈环状，裸藻中有34 的叶绿体 DNA为环状。v二：一部分叶绿体DNA分子以二聚体、三聚 体或四聚体的形式存在，其机理目前还不清 楚，很可能是几个单体之间发生了重组之故 。The structure of
6、 chloroplast genome三：植物叶绿体DNA一般为l20160 kb。v藻类尤其是绿藻的叶绿体基因组DNA的变化很大，小的只有 37 kb，如一种寄生性的绿藻(Helicosporidium spe Simulium onesii)，而伞藻的叶绿体基因组则高达2000 kb 。 四：叶绿体基因组的结构非常保守。v双链环形DNA有4个基本部分组成，分别是大单拷贝区(1arge single copy region，LSC)， 小单拷贝区(small single copy region，ssc)， 反向重复区A(inverted repeat region A， 和反向重复区B(i
7、nverted repeat region B， B)2个区域的序列相同，但方向相反。The inverted repeat (IR)v不同物种叶绿体基因组之间的差异主要表现在IR区域的长度 和方向变化上v在长度变化上，裸子植物如日本黑松(Pinus thunbergii)的IR 区间已经萎缩成仅有的495 bp，而一些豆科植物如豌豆 (Pisum sativum)和剪叶苜蓿(Medicagotruncatula)的IR 区间 甚至已经完全消失了与此形成对比的是IR 区域长度的增加 ， 如天竺葵(Pelargonium honorum)在进化过程中， 区段增 加成了76 kb，纤细裸藻(Eug
8、lena gracilis)含有3个方向相同 的串联重复DNA。IR区域的方向上同样存在变化，紫红紫菜 (Porphyra purpurea) 中的 IR为同向重复，而条斑紫菜 (Porphyra yezoensis)则为反向重复。The inverted repeat (IR)The function of chloroplast genomevGene expressionvPhotosynthesisvMetabolismThe function of chloroplast genomeIR区域主要分布着编码rRNA的基因 (rps)，包括编码16 S和23 S， 中间被 编码45 S
9、和5 S 2+tRNA的基因(m) 分开，还有些基因的功能未知(yc 因) LSC和SSC区域分布的主要是与光系统 I(psa) 、光系统(psb)有关的基因，此 外还包括编码Rubisco大亚基(rbcL)和小 亚基的基因(rbcS)、tRNA的基因(trn)、 ATP酶基因( p)、NADH质体醌氧化还原 酶基因(ndh)和RNA聚合酶基因( o)等ZeaZea (75)(75)OryzaOryza (75)(75)NicotianaNicotiana (76) (76)PinusPinus (69)(69)MarchantiaMarchantia (84)(84)Euglena Eugl
10、ena (58)(58)PorphyraPorphyra (200) (200)OdontellaOdontella (124)(124)CyanophoraCyanophora (136)(136)1 (0)1 (0)5 (2)5 (2)12 (0)12 (0)4 (0)4 (0)1 (0)1 (0)7 (5)7 (5)34 (9)34 (9)129 (34)129 (34)20 (1)20 (1)1 (0)1 (0)77 (0)77 (0)99 (3)99 (3)AncestralAncestral plastidplastid ( (235)235)14 (14)14 (14)Gene
11、loss in chloroplast evolution 45 genes present in all genomes Unique losses (68) outnumbered by parallel losses (122) Confirms that ancestral plastid genome was already highly reduced from that of cyanobacteriaGene loss in chloroplast evolutionThe regulation of chloroplast evolutionv转录水平的调节主要依靠RNA转录
12、酶水平变化来实 现。vRNA加工：大多数叶绿体内含子以类似核和线粒体 内含子切除方式剪接。v翻译机制：类似于大肠杆菌的翻译机制。叶绿体基因表达调控是在不同水平上进行 的，如转录水平的调节、转录后调节与修 饰、翻译和翻译后修饰等。The regulation of chloroplast evolutionv光合细胞分裂素对叶绿体基因的表达起着重 要的调节作用。v光既可以诱导基因的转录活性，也可以提高mRNA的稳定性 和翻译水平。v细胞分裂素对叶绿体基因的表达调控则主要发生在翻译水平 上。v经细胞分裂素处理后，叶绿体基因编码的类囊体膜复合体蛋 白的转录水平变化不大，但蛋白翻译水平大幅提高。Chl
13、oroplast Genetic EngineeringChloroplast Genetic Engineeringv叶绿体作为基因工程受体的优点：v(1)每个植物细胞中都存在大量的叶绿体拷贝，使得 外源基因的表达量往往是在核基因组中表达的几百 倍。v(2)外源基因通过同源重组过程而定点整合在叶绿体 基因组中，无位置效应，也不会产生基因沉默现象 。v(3)具有母性遗传的特点，避免了核转基因系统中因 花粉逃逸带来的生物安全性问题。 v(4)大多数叶绿体基因以操纵子的形式存在，使在叶 绿体中同时转化与表达多个外源基因成为一种可能 。Chloroplast Genetic Engineeringv
14、筛选标记基因的选择：v突变型16S rRNA基因：。由于突变型16S rRNA基因的导入，使 得转化细胞能抗壮观霉素、链霉素或林可霉素对叶绿体蛋白 合成的抑制。vNPT II基因：来自于细菌的N PTII基因编码新霉素磷酸转移酶 ，能赋予细胞抗卡那霉素的能力，这是核转化中常用的一种 筛选标记。vaadA基因：来自于原核生物，编码氨基糖苷-3-腺苷酸转移酶 ，能产生壮观霉素和链霉素抗性，aadA基因是目前叶绿体 转化中最常用、最好的筛选标记。v荧光标记基因：将绿色荧光蛋白基因(gfp)和壮观霉素的抗性基 因(aadA)构成融合基因，构建在叶绿体表达载体中。Chloroplast Genetic
15、Engineeringv表达载体导入叶绿体的方法vPEG介导转化法v基因枪法v花粉管导入法v显微注射法v农杆菌转化法v激光穿刺法v转运肽介导的叶绿体间接转化法PEG介导转化法vPEG法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原 生质体暴露在纯化的外源DNA中，由于PEG的存在 ，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构 ，细胞膜结构在到达不可逆破坏之前除去PEG，细 胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。就在此 过程中，外源DNA有机会进入胞内及质体内，从而 实现转化。v该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比 较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制 了这一方法的普遍应用。到目前为止
16、，PEG法只有 报道在烟草质体转化中获得成功。基因枪法v它是将外源DNA(通常是带有目的基因的质粒 载体1黏附在金属颗粒(如金、钨等)表面，然 后通过高压动力装置将金属颗粒轰击到受体 细胞中的特定部位。v基因枪法不受基因型和物种限制，转化后的 组织可以迅速再生成植株，到目前为止，叶 绿体转基因植株大都通过基因枪法得到的， 因此成为最有效的叶绿体遗传转化方法。转化技术原理一：通过叶绿体特异性启动子、终止子及5LUTR 和3-UTR区序列实现目的基因的高效表达。v常用的启动子为叶绿体的16S rDNA基因的启动子Prrn和光系 统作用中心的启动子psbA；v常用的终止子为叶绿体的psbA基因的终止子TpsbA和rpsl6基 因的终止子Trps16v3非翻译区(3-untranslated regions，3-UTRs)和5非翻译区 (5-untranslated regions，5-UTRs)所包含的序列和结构因子 与特异的蛋白质相互作用可以影响RNA 的成熟和RNA稳定性 。转化技术原理v
