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1、*无菌工艺验证培养基灌封试验主讲人： 崔强2008年3月E-mail: 1*为什么需要 进行培养基灌封试验 ？2*来自生产工艺的要求对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。 但有大量药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺方 法。无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无菌 是该工艺最大的难点。减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施 人员培训 无菌工艺验证3*最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异最终灭菌工艺在高洁净净环境下进行灌装和密 封通常，产品、容器和密封件的微 生物污染水平很低在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭 菌，然后进行灌封在极高洁净环
2、境下进行灌装和密 封产品在最终容器中不再做进一步 的灭菌处理对各个组成部分的灭菌工艺需要 进行严格验证和监控在灌封前和灌封过程中的操作会 带来污染风险空瓶 灭菌 隧道密封件蒸汽灭菌釜除菌 过滤人员半压 塞瓶冻干机全压 塞瓶4*来自FDA和USP的要求FDA CGMP 无菌工艺药品指南（2004年版）An aseptic processing operation should be validated using a microbiological growth medium in place of the product. This process simulation, also known
3、 as a media fill. USP 31 洁净室和其它控制环境的微生物学评 价To assure that minimal bioburden is achieved, additional information on the evaluation of the microbiological status of the controlled environment can be obtained by the use of media fills. An acceptable media fill shows that a successful simulated product
4、run can be conducted on the manufacturing line at that point in time. 5*来自EU GMP和国内的要求EU GMP 附件1 无菌药品的生产（2008年2月新版）Validation of aseptic processing should include a process simulation test using a nutrient medium (media fill).中国药品生产质量管理规范 附录（1998年修订）SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行） 培养基灌装验证是对设备、环境以及人员操作的一种系统验
5、证,是判断无菌保证水平的关键手段 采用无菌生产工艺的粉针剂，应能保证SAL不大于10-3 6*无菌工艺产品的无菌保证无菌工艺产品PersonnelEnvironment工艺验证人员原料环境无菌检验7*作业环节与风险作业环节验证难 易度人员依赖程度相关风险灭菌易低低房间设计N/AN/A中等环境监测中等可变高消毒难高高更衣难很高很高物品转移难高高无菌技术（灌封）难很高很高无菌装配难很高很高8*培养基灌封实验的 常规要求9*定义与目的 目的 证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力 对人员进行资格确认 符合cGMP的要求使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进 行验证。又称为“工艺模拟试验”.1
6、0*工艺模拟试验的通常流程将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键 环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌 原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。 11*培养基灌封试验的时机 初始验证与再验证初始验证需要重复多次，以确保结果的一致性和有效性。有差异的多次实验结果工艺过程失控的象征定期再验证定期进行，评估无菌工艺的受控情况。应综合考虑每一班次及班次变化过程中有代表性的活 动及干预。对人员的资格再确认应纳入到定期再验证中。12*培养基灌封试验的时机 增补性培养基灌封试验变更及其
7、评估对产品或生产线的每一种变更，均应根据书 面的变更控制系统进行评估 。如果通过评估认为此项变更会影响到无菌生 产工艺产品的无菌保证水平，则需要进行增 补性培养基灌封实验。比如，设施或设备的变化、生产线配置的变 动、人员重要变动、环境监控结果异常、容 器-胶塞系统变更、停车时间延长、无菌检查 结果阳性等。13*实验用培养基和培养温度的选择选择时的注意事项适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌较好的澄明度，较小的粘度易于除菌过滤常用培养基：3大豆胰蛋白肉汤（TSB）厌氧培养基仅在特殊情况下使用培养温度FDA - 20-35，目标值2.5，不少于14天；如选择 两个温度，则每一温度下至少培养7天，从低
8、温开始。PIC - 20-25下至少14天，或，先20-25下7天， 然 后30-35下7天。14*灌装体积与数量灌装体积每只容器的灌装体积不少于总容积的1/3同样，灌装体积也不宜过大既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器 和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持 微生物生长。灌封数量综合考虑统计学要求和实际生产批量。FDA (5000瓶)：如果正常生产的批次量低于5000瓶， 则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。PIC (3000瓶)：如果正常生产的批次量低于3000瓶， 则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。15*灌封时间与批次量控制灌装时间对于初始性验证，
9、培养基灌封实验应安排在一周内的不 同时间进行。对于再验证，可选择在一周结束或其它最差条件下进行 。灌封时间要涵盖实际生产班次。批次量控制初次验证，至少要连续成功灌封3个批次。再验证至少需要成功灌封1个批次。16*培养基灌封实验的合格标准FDA指南（2004版）与EU GMP 附件1标准统一l灌封量10000瓶时，若有1瓶污染，需彻底调查 ；若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验 证（3批）。注：欧盟标准将自2009年3月起执行。17*培养基灌封实验的合格标准2009年3月以前欧盟通用标准：污染率低于0.1%计算公式：实际污染率 = (95%置信限值)/(灌封容器数) 100%污染瓶数与95%
10、置信限值间的关系污染 瓶数01234567891095% 置信 限值34.746.37.759.1510.51 11.8413.1514.4315.7116.9618*培养基灌封实验的合格标准SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行）培养基灌装试验的批量与判断合格的标准批量（瓶）3000475063007760允许污染的数量（瓶 ）0 1 2 319*不同剂型的特殊要求20*冻干制剂对培养基灌封的要求冻干制剂的典型生产流程配制灌装冻干加塞轧盖第一种方式，模拟装载/卸载过程，缩短放置时间（首选）容器内灌封好培养基，以半压塞状态装入冻干机冻干机内部分抽真空（500mbar），在室温放置一定的时间
11、 ，不得冷冻。用无菌空气破真空（不使用惰性气体），全压塞轧盖注意，若所使用的容器透明度不高，应将内容物倒出进行检查 。冻干制剂培养基灌封试验的特殊性对产品在冻干机内放置步骤的模拟21*冻干制剂对培养基灌封的要求第二种方式，模拟冻干时间半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。缺点：耗时长第三种方式，以经稀释的培养基模拟冻干过程容器内灌封好经稀释的培养基（diluted medium），以半压 塞状态装入冻干机模拟冻干过程，直到容器内的培养基大致达到正常浓度（ full strength）为止。缺点：耗时长，需开发特殊的冻干程序，营养支持性不均 一，影响微生物的存活力。22*粉针剂对培养基
12、灌封的要求第一种方法在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞-轧盖 或熔封。第二种方法先灌装干粉培养基，再加入注射用水第三种方法先灌装惰性剂，再加入液体培养基要点采用第二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需 事先经过辐射灭菌。常用惰性剂有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖 。23*混悬剂/半固体制剂对培养基灌封的要求悬浮剂需要模拟搅拌或循环流动的过程。如果有无菌添加过程，也应进行模拟。半固体制剂需要将液体培养基增稠到适当粘度。可选用琼脂或羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其 它试剂，但要证明其没有抑制细菌或真菌的作用。在培养结束后，需将培养基从塑料或金属管中挤出检 查其混浊度和真菌菌落，也可
13、进行无菌检查实验。如果选择显色培养基遇到污染物变色的方法，则需要 对其进行验证。24*方案 与 报告25*制订培养基灌封实验方案的考虑因素（一）生产线最长运行时间及其造成的相关风险干预的次数、类型和复杂程度是否有冻干工序设备的无菌装配总人数和所从事的操作无菌加入和无菌转移的次数班次更换、暂停和必要的更衣无菌设备的拆卸与连接环境监测26*制订培养基灌封实验方案的考虑因素（二）生产线的配置和运行速度产品重量检查容器/密封系统与无菌操作相关的各种特殊规定总人数和所从事的操作n总的原则n综合考虑生产线可能造成污染的各种因素 n尽可能模拟实际生产的无菌操作 n可能时，应包括最差条件的模拟测试 27*验证
14、开始前的准备工作设备确认通风系统（HVAC）的确认设备的在线清洗和灭菌CIP,SIP灭（除）菌工艺验证湿热、干热灭菌工艺除菌过滤空气过滤器的完好性检测容器/胶塞密封完好性测试人员培训洁净室环境达到设计要求28*培养基灌封实验方案的内容举例定义被模拟的工艺定义使用的房间，灌封线 和设备使用的容器和密封件的类 型灌装线的速度灌封数量模拟过程中的干扰和中断 的数目和类型参与的人员数目使用的培养基灌封到容器内培养基的体积选择的最差条件及其原理培养条件，培养温度，培养 时间所进行的环境监测批记录复印件职责说明所有工作的合格标准列举最终报告中需要的文件本次模拟的持续时间29*方案的执行与记录（一）培养基灌
15、封的日期和时间使用的房间和设备容器胶塞的型号和尺寸培养基种类和灭菌方式每容器中的灌装体积灌装速度灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因培养的瓶数，阳性的数量培养时间和温度30*方案的执行与记录（二）环境监测的数据参与培养基灌封的人员培养基灵敏度检查的结果有无阳性结果。如有，要给出 微生物鉴定的结果。如发生异常情况，需给出调查 报告。31*培养基灌封实验中的环境监测环境监测按照相应的规程进行，包括：空气粒子数沉降碟浮游菌表面监测人员监测n对无菌生产区环境的评估32*培养基灌封实验中的灵敏度检查实验n培养基灵敏度检查实验：使用完成14天培养的灌封前期培养基样品n用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿 假单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌n将每个菌种准备含100cfu/0.1ml的菌液，每个菌种接种2 支培养基样品，同时并平板计数（双份）n对真菌在20-25C下培养，对细菌在30-35 C下培养，每 天检查，5天内需有生长迹象33*再验证与增补性验证的要求再验证对每条生产线，每年进行两次再验证，间隔时间为5-7个 月 。人员至少每年参加一次再验证，以
