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1、流感疫苗生产及研究进展内容病毒性灭活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生产工艺3 3流感疫苗研发4 4病毒性灭活疫苗概述 定义及分类病毒接种和培养采用物理或化 学的方式将病 毒灭活其他的生 产步骤成品培养基质流感疫苗：鸡胚出血热及森脑疫 苗：原代地鼠肾 细胞狂犬疫苗：Vero 细胞灭活方法： 加热 灭活剂（福 尔马林等）纯化：纯化全病 毒疫苗裂解：裂解疫苗亚单位：亚单位 疫苗纯化全病毒疫苗 ： 冻干人用狂犬病 疫苗出血热、森脑 -含氢氧化铝 佐剂裂解：流感病毒 裂解疫苗灭活疫苗：称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养 的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性，并
2、 结合相应的佐剂而制成的疫苗。长春公司的病毒性灭活疫苗工艺流程名称病毒培养病毒纯化病毒裂解病毒灭活半成品配 制及分包 装冻干人用狂犬 病疫苗基质：Vero细 胞培养 方式：生物反 应器超滤浓缩 ； 柱层析（ 分子筛）无灭活剂：- 丙内酯冻 干双价肾综合征 出血热疫苗 森林脑炎灭活 疫苗基质：原代地 鼠肾细胞 方式：转瓶超滤浓缩 ； 柱层析（ 分子筛）无灭活剂：甲醛含铝佐剂流感病毒裂解 疫苗基质：鸡胚 方式：孵化间超滤浓缩 ； 蔗糖密度 区带离心裂解剂： Triton X -100灭活剂：甲醛无硫柳汞两种灭活剂的比较简要介绍灭活机理优缺点甲醛甲醛，化学式 HCHO，称蚁醛。 无色气体，有特 殊的
3、刺激气味， 对人眼、鼻等有 刺激作用。既可作用于病毒含 氨基的核苷酸碱基 （如A,G,U），又可 作用病毒壳蛋白。1）病原体蛋白的抗原性严重破坏， 可能有病原体存活； 2）灭活时间长； 3）易受温度、pH、浓度、是否存在 有机物、病原体的种类和含氮量等 因素影响； 4）残留的游离甲醛，注入机体后， 会产生制激性反应。-丙 内酯一种杂环类化合 物(C3H4O2)，沸 点155，常温 下是无色粘稠状 液体，对病毒具 有很强的灭活作 用。作用于病原体DNA或 RNA，改变病毒核酸 结构达到灭活目的 ，而不直接作用于 蛋白。 1）不破坏病毒的血凝素抗原, 保持 病毒良好的免疫原性； 2）灭活时间短；
4、3）其水解产物对机体无害，接种反 应轻。常用的裂解剂简要介绍机理Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一种非离 子型表面活性剂（或称去污剂）它能溶解脂质，以增加 抗体对细胞膜的通透性 。Triton N-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一种非 离子型表面活性剂（或称去污剂）溶解脂质CTAB十六烷基三甲基溴化铵,阳离子表 面活性剂，是一种阳离子去污剂与非离子及两性离子表 面活性剂有良好的配位 性，对多种油脂具较好 的乳化作用, 有轻微脱 脂作用. 流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、 乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别引起的急性呼 吸道传染病。常造成不同程度的流行，对人
5、类的健 康造成巨大的威胁。慢性病恶化、继发感染、其它- 痛苦不堪 - 缺课或缺勤 - 就医 - 使用抗生素 - 住院 - 死亡流感流感和流感病毒流感的流行特点 是在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行， 包括世界大流行，局部暴发流行及散发。 具有一定的季节性：温、寒带地区常在冬、春季节流行， 但热带和亚热带地区任何季节都可以流行。 流感病毒传播迅速、流行广泛、抗原易变异，人群的特异 性免疫状况不稳定。 发病率高，并伴有一定的死亡率。最高的为青少年，高危 人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在 人群中总要造成不同程度的超额死亡。 流感患者和隐性感染者是流感的主要传染源。从潜伏
6、期末 到发病的急性期（约7天）都有传染性。死亡率升高超过一定的正常临界水平流感病毒形态结构流感病毒的超细微结构照片流感病毒电镜照片流感病毒形态结构甲型流感病毒基因组各节段的大小与功能节段 长度（bp）编码蛋白 主要功能RNAI 2341 PB2 RNA转录酶；识别和结合来源于宿主细胞的帽子 RNA2 2320 PB1 RNA转录酶主要成分；启动转录和RNA合成延伸 RNA3 2233 PA 具有解旋酶话性 RNA4 1778 HA 结合靶细胞受体，诱导病毒与靶细胞融合诱导中和抗体，凝集红细胞 RNA5 1565 NP 与基因组RNA结合，参与形成核糖核蛋白（RNP）颗粒 RNA6 1413 N
7、A NA活性；水解细胞多糖受体，协助新生病毒颗粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促使子代病毒释放 RNA7 1027 M1、M2 病毒基质膜蛋白，有保护作 用；质子通道作用 RNA8 890 NS1、NS2 非结构蛋白，抑制宿主细胞蛋白合成或参与vRNA合成流感病毒的理化特性 流感病毒对热敏感，通常5630min被灭活，但有些毒株5690min被灭活。 最适PH为7.0-8.0可被紫外线灭活因其为带囊膜的病毒，故对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。流感病毒的变异n原因： 流感病毒结构特点 天然宿主的广泛存 在 密切接触n方式： 抗原漂移（Antigenic drift）-小变异，同一亚型-基因点突
8、变所致-引起流行抗原转换（Antigenic shift）-大变异-基因片段交换-引起大流行抗原漂移（抗原漂移（Antigenic DriftAntigenic Drift）RNASialic acidAntibodiesHemagglutininNeuraminidaseHA 和/或 NA 基因的点的变异 频繁发生 A 型和B型发生抗原转换（抗原转换（Antigenic shift)Antigenic shift)人类和动物毒株的RNA发生交换 (HA 和/或NA基因的全球性变异),导致新的 亚型出现 少见但后果严重 只在 A型出现 191819401960198020002020H1N1H
9、2N2H3N2H1N1H1N11918Spanish Influenza H1N11957Asian Influenza H2N21968Hong Kong Influenza H3N22009Novel Influenza H1N1H71980198519952005197519962002H520021997H91999流感的流行情况抗原漂移所引起的历史上的流感流行 PB1 HA NAPB1 NAN Engl J Med 10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒 4种不同来源的基因 4 different genes: 北美猪流感病毒 North America sw
10、ine 欧亚猪流感病毒 Asia/Europe swine 人流感病毒 Human influenza 禽流感病毒 (非H5) Avian (Non-H5)流感的实验室诊断流感已成为全球患病人数最多的一类疾病。接种流感疫苗是目前预防和控制流感最经济、最有效的手段，已被广泛采用，并证明有效率达到 70以上。流感疫苗目前，使用的流感疫苗是三价的，包括两种甲 型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗原成分 ，应用最广泛的有：灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV
11、）：2-49岁当前主要应用的疫苗种类u 灭活疫苗种类和生产工艺全病毒疫苗 裂解疫苗 亚单位疫苗第一代全病毒价格较低，但副反应较高，部分人群不适宜接种，已逐 渐淘汰第二代裂解接种效果好，临床副反应较少，适合各年龄段人群接种第三代亚单位有效抗原含量高，更安全，价格较高灭活疫苗种类3-4月份 10-11月份WHO发布毒株生产企业获得 和培育毒株疫苗生产销售每年世界卫 生组织根据 上一年流感 病毒流行情 况预测下一 年度流感病 毒流行株并 向各生产企 业发布从WHO合作 实验室获得 病毒疫苗株 ，并将病毒 在鸡胚内培 养，制备毒 种将病毒接种 到鸡胚内培 养，收获尿 囊液，经纯 化、灭活、 裂解后制备
12、 成疫苗2月份 9月份5-9月份 12-次年4月9月-次年2月份 5月-9月生产周期5-6个月生产工艺生产工艺单价原液制备毒种和病毒尿囊液制备毒种MOI 接种量温湿度 培养时间 通风温度 时间颜色 量选胚接种培养收获纯化裂解产品名称检定项目药典标准 主代种子无菌检查无菌生长 血凝滴度不低于1：320 支原体检查符合规定鉴别试验采用交叉血凝抑制法， P/N不低于8 病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml 外源性禽白血病病毒检测阴性 外源性禽腺病毒检测阴性 工作种子无菌检查无菌生长 血凝滴度不低于1：320 支原体检查符合规定鉴别试验采用交叉血凝抑制法， P/N不低于8 病毒滴度不低于6.5L
13、g EID50/ml质量控制中间产品质量控制中间品检定项目长春公司企业注册标准病毒收获液微生物限度105CFU/ml 沙门氏菌阴性 血凝滴度1:160 细菌内毒素10EU/ml 蛋白含量3.5mg/ml 病毒浓缩液蛋白含量10mg/ml 细菌内毒素160EU/ml 病毒纯化液蛋白含量2.0mg/ml 病毒裂解 纯化液蛋白含量0.5mg/ml病毒灭活 纯化液细菌内毒素0.2EU/ugHA 灭活验证实验符合规定微生物限度10CFU/ml单价病毒原液质量控制单价病毒原液检定项目长春公司企业注册标准鉴别实验抗原性与推荐的病毒株相一致血凝素含量90ug/ml蛋白含量不高于血凝素含量的4.0倍无菌检查符合
14、规定病毒裂解 效果检查病毒颗粒应裂解完全。每次更换 流感病毒毒株后生产的前三批单 价病毒液须进行该项检查。 某些病毒能够与人或动物的红细胞发生凝 集，这称之为红细胞凝集反应（HA）。这 种凝集反应被加入的特异性血清所抑制， 即为红细胞凝集抑制试验（HI）。血凝和血凝抑制试验血凝和血凝抑制试验血凝素含量检测（单扩）标准直线半成品质量控制半成品检定项目长春公司企业注册标准无菌检查符合规定血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素 含量应为配制量的80%120%裂解剂残留量150ug/ml成品检测指标成品检定项目长春公司规程标准鉴别实验抗原性与推荐的病毒株相一致外观微乳白色液体，无异味 装量应不低于标示
15、量 pH值6.87.8血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量 应为配制量的80%120% 游离甲醛含量50ug/ml 卵清蛋白含量100ng/ml总蛋白含量350ug/ml,不高于血凝素总含量 的3.5倍 细菌内毒素20EU/ml 抗生素残留量50ng/剂 无菌检查符合规定 异常毒性检查符合规定 目前广泛应用流感疫苗 季节性四价流感疫苗 细胞基质流感疫苗 喷鼻减毒活疫苗 基因工程流感疫苗 病毒样颗粒、病毒载体及DNA流感疫苗 通用流感疫苗研发与展望疫苗效果影响因素接种疫苗是当今预防和控制流感发生和流行最 有效的手段。目前，使用的流感疫苗是三价的，包括 两种甲型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗 原成分，应用最广泛的有：灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁目前广泛应用的流感疫苗近年获批上市的新型流感疫苗 充实一下新型流感疫苗表疫苗种类商品名厂家批准地批准时间剂量对
