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1、1第七章 分子发光分析分子发光包括分子荧光(fluorescence)、 分子磷光(phosphorescence)、化学发光 (chemiluminescence) 等。2处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。物质吸收 光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。这一机理 同样适用于说明化学发光和生物发光的原理。1 荧光和磷光的基本原理3电子激发态的多重度可用M = 2S + 1表示（或 ），多数分子含有偶数电子，根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向， 即自旋配对。假如
2、分子中任一轨道都是自旋配对的，此时S = 0，所以分子的多重度M = 1，分子体系处于单重态，一般 用符号S表示。大多数有机分子的基态处于单重态一.分子荧光和磷光的产生分子吸收和发射过程的能级图（Jablonski能级图）u两类电子激发态4分子吸收外界辐射能量后，如果电子在跃迁过程中不 发生自旋方向上的变化，这时分子就处于激发的单重态， 图中基态用S0表示，第一电子激发单重态和第二电子激发 单重态分别用S1、S2表示。如果电子在跃迁过程中发生了自旋方向的改变，这时 分子便具有两个自旋不配对的电子，此时S = 1，分子的多 重度M = 3，即分子处于激发的三重态，用符号T表示。电 子激发三重态分
3、别用T1、T2表示， = 0、1、2、3 表示基态和各个激发态的振动能级。基态单重态 激发单重态 激发三重态S0 S1 S2 T1 T2 处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能 级总是比单重态能级略低。 S2S1S0T1吸 收发 射 荧 光发 射 磷 光系间跨越内转换振动弛豫能 量l 2l 1l 3外转换l 2 T2内转换振动弛豫Jablonski diagram7Jablonski diagram8传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光
4、：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410 s；第一激发三重态的最低振动能级基态；2. 去活化过程（Deactivation） 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 。这些过程包括：9(1)振动弛豫(Vibration relaxation，简写为VR)在凝聚相体系中，被激发到激发单重态分子能通过与溶剂分子间的碰撞，以热的形式分子可将多余的振动能量传递给周 围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最 低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间 为1012S数量级。10(2)内转换(Internal con
5、version，简写为IC)当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁 形式转移至低电子能级。这个过程称为内部转移。内部转移 的时间为1011S1013S数量级。振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个 激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低( 第一)激发单重态的最低振动能级。113)外部转移(External conversion,EC) 激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减 弱甚至消失，这种现
6、象称为猝灭或熄灭。 12(4)系间跨跃(Intersystem Crossing, ISC) 系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态S1跃 迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配 对。这种跃迁是禁阻的，但如果两个能态的能层有较大重叠 时，S1的最低振动能级与 T1的较高振动能级重叠，就有可 能通过自旋一轨道偶合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速 度很小，经历的时间较长。13(3)荧光发射(Fluorescence emission,FE)处于激的单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(v
7、=0)后，以辐射的形式跃 迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射。电于经过 振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子 吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长。第 一发单重态最低振动能级的平均寿命为109104S，因此荧 光寿命也在这一数量级。145)磷光发射(Phosphorescence emission)激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级， 然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷 光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速 度很慢。磷光的寿命为10410 S。因此，外光源照射
8、停 止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1 中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要 长。15二荧光量子产率荧光量子产率 ( )：表示物质发射荧光的能力式中，K为荧光发射过程的速率常数，Ki为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常 ，kF 由分子结构决定（内因），而Ki则由化学环境和结构共同决定。16三荧光的激发光谱和发射光谱 u激发光谱 通过固定发射波长，扫描激发波长而获得的荧光强度激发波长的关系曲线，称为激发光谱。激发光谱反映了在某 一固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光相对效率。u发射光谱(
9、也称荧光光谱)通过固定激发波长，扫描发射波长所获得的荧光强度发射波长的关系曲线称为荧光发射光谱。它反映了在相同的 激发条件系，不同波长处分子的相对发射强度。荧光发射光 谱可用于荧光物质的鉴别。图2. 罗丹明B类化合物的激发(1, em = 640 nm ) 和发射光谱(2, ex = 480 nm )波长/ nm荧光强度可确定最大激 发及最大发射 波长18四荧光发射光谱的特征 (1) 斯托克斯(Stokes)位移在溶液的荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发光的波长。Stokes于 1852年首次发现这种波长位移现象，故称 Stokes位移。*斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一
10、定 的能量损失。Stokes19u激发态分子由于振动弛豫及内转换的无辐射跃迁而迅速 衰变到S1电子态的最低振动能级，这是产生其位移的主要 原因；产生Stokes位移的原因：u荧光发射时，激发态的分子衰变到基态的各振动能级， 此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也 造成能量的损失；u溶剂效应以及激发态分子可能发生的某些反应，也会加 大斯托克斯位移。20(2) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关波长/ nm荧光强度图3. 不同激发波长下4-甲基伞形酮的荧光光谱21由于荧光发射是激发态的分子由S1的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大， 能把电子激发到哪种激
11、发态，都将经过迅速的振动弛豫及内 转换跃迁至S1的最低振动能级，然后发射荧光。因此荧光发 射光谱的形状与激发波长无关。原 因:22图4. 芘的吸收光谱及荧光发射光谱(3) 荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称23解释：能层结构相似性荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。S1S024实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由*或 n *跃迁激发，然后经过振动弛豫等
12、无辐射跃迁，再发生 * 或 * n 跃迁而产生荧光。而其中*时的摩尔 吸光系数比n* 跃迁的大102103倍， * 跃迁的寿 命(107109)比n* 跃迁的寿命(10510-7)短，因此 荧光发射的速常数Kf值较大，荧光发射的效率高。因此， * 跃迁发射荧光的强度大。总之， * 跃迁的类型 是产生荧光的最主要跃迁类型。 u跃迁类型：五影响荧光强度的因素25u共轭效应：发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共键双键(键)的结构体系。共轭体系越大， 电子的离域性越大，越容 易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。 大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或 磷光)峰越向长波
13、移动，且荧光强度往往也较强。 化合物量子产率 F ex（ nm） em（nm ）苯0.11205278萘0.29286321蒽0.4636540027u刚性结构：实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可为减少分子的振动，使分 子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能 量处部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以 增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。 0.92 01 0.1829u取代基的影响 1)给电子取代基使荧光加强 属于这类基团的有NH2，NHR，NR2，OH，OR，CN等。由于这些基团上的n电子云几乎与芳环上的电子
14、轨 道平行，因而实际上它们共享了共轭电子，形成了p共 轭，扩大共轭体系。因此，这类化合物的荧光强度增大 2)吸电子基团使荧光减弱而磷光增强 如-COOH、-C=O、 -NO2、-NO、-X等.这类基团都会发生n* 跃迁，属于禁阻跃迁，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱 ，而 S1-T1 的系间跨跃较为强烈，同样使荧光减弱，相应磷 光增强。 304) 重原子效应荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和I)原子取 代，芳烃取代上卤素原子这后，其荧光强度随卤素原子量增 加而减弱，而磷光通常相应地增强，这种效应称为“重原子 效应”。这种效应被解释为
15、，由于重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，使得荧光体中的电子自旋一轨道偶合作用 加强，系间跨跃显著增加，结果导致荧强度减弱，磷光强度 增强。 3)取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位、对位取代者增荧光，间位取代者抑制荧光(CN取代者例外)。以上为内在因素.31外在因素:u溶剂效应： 溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变 *及 n* 跃迁的能量）；u温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、 粘度 或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。upH值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧 光物质，因
16、pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。u荧光猝灭：碰撞猝灭；静态猝灭；转入三重态的 猝灭； 电子转移猝灭；自猝灭。u内滤作用和自吸现象：当溶液中存在能吸收荧光物质的激 发光或发射光的物质时，也会使体系的荧光减弱，这种现象 称为内滤作用。如果荧光物质的荧光发射光谱在该物质的吸收光谱有重 叠，当荧光物质浓度较大时，一部分荧光发射可被自身吸收 ， 从而使荧光强度降低，称为自吸。这种自吸现象也是一 种内滤作用。六定量分析（，荧光量子产率）u这种线性关系只有在极稀的溶液中才成立。对于较浓的溶 液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不成 线性关系。 u荧光强度大小与: （1）荧光体浓度成正比;（2）激发光强度成正比;（3）测量仪器有关.36Absorbance Deviation (%)0.0010
