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1、1黄连消渴颗粒提取工艺改进的研究作者：邓月婷 马超英 陈陆 蒋合众 李燕【摘要 】 目的改进黄连消渴颗粒的提取工艺。方法分别以盐酸小檗碱和多糖的含量为指标，采用正交设计法和单因素比较法，设计优选了黄连消渴颗粒剂的提取工艺。结果优选出的提取工艺为：黄连与原方中其余四味药分开提取；黄连粗粉浸泡 30 min 后，用12，10 倍量水提取 2 次，提取时间均为 1.5 h；其余 4 味药一起提取，浸泡 30 min，加 10 倍量水提取 1 次，提取时间为 1.5 h。 结论该实验确定的提取工艺方法合理，稳定可行。 【关键词】 盐酸小檗碱 多糖 提取工艺Abstract：ObjectiveTo im
2、prove the extraction technology of Huang-lian-xiao-ke Granule. MethodsThe extraction technology for Huang-lian-xiao-ke Granule was optimized through single comparative and orthogonal law with the use of the extraction rate of berberine hydrochloride and polysaccharide as the assessment index. Result
3、sThe optimized extraction technology for Huang-lian-xiao-ke Granule was as follows: Copis chinensis Franch. and the other 2four kinds of raw materials in the origin prescription were decocted separately; after soaked for 30min, the coarse powder of Copis chinensis Franch was decocted with 12,10 time
4、s water each time and both for 1.5h; after soaked for 30min, the four kinds of raw materials were decocted together for 1.5h just one time with 10 times water. ConclusionThe extraction technology is reasonable, stable and easy to operate.Key words：Berberine hydrochloride； Polysaccharide； Extraction
5、technology黄连消渴颗粒是本课题组在研的一个六类中药新药，由黄连、黄芪、山药等 5 味药组成，具有清热润燥、益气养阴、生津止渴等功效，临床上主要用于治疗消渴(2 型糖尿病) 1 。为了充分提取有效成分，提高疗效，同时也为制成固体制剂提供实验依据，本文对其提取工艺进行了研究。因方中降血糖的主要成分为盐酸小檗碱和多糖，根据其性质及该方的临床应用，故初步确定君药黄连与其余4 味药分开提取，均用水提。1 仪器与材料3以上 5 味药材均购于四川峨眉仙山中药科技发展有限公司。黄连 Copis chinensis Franch.为川产味连，黄芪 Astragalus membranaceus (Fi
6、sch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao 为蒙古黄芪，山药 Dioscorea opposita Thunb.为怀山药，其他药材均为主产地优质药材，经西南交通大学中药研究所鉴定均为正品。无水葡萄糖对照品由中国药品生物制品检验所提供，批号：110833-200302；盐酸小檗碱对照品由中国药品生物制品检验所提供，批号：110713-200208 ；乙腈、乙醇、磷酸二氢钾均为色谱纯，浓硫酸、苯酚为分析纯；岛津 UV300 紫外分光光度计；岛津 LC-20AT 高效液相色谱仪。2 方法与结果 2.1 黄连提取工艺的考察2.1.1 正交实验设计 根据预试结果，以
7、提取时间、料液比、提取次数为 3 因素，每个因素 3 个水平，进行 L9（34 ）正交实验。因素水平设计表见表 1。2.1.2 正交实验方法与结果称取 9 份黄连粗粉，每份 12 g，按照表 1 所列因素和水平，加水浸泡 30 min 后回流提取，趁热抽滤，将提取液定容至 500 ml。精密量取以上提取液 2 ml，用无水4乙醇定容至 10 ml。离心，取上清液 1 ml，再用无水乙醇定容至10 ml，用 0.45 m 微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。按照“2.1.3” 项下方法测定盐酸小檗碱的含量。结果见表 2。表 1 因素水平表（略）表 2 正交实验结果（略）由正交实验结果可知，影响
8、提取效果的因素顺序为：C（提取次数）A（提取时间）B（料液比） 。极差结果为A3A2A1，B3B2B1 ，C3 C2C1，直观分析确定最佳提取工艺为：A3B3C3 。鉴于提取次数（C ）的拐点在 C2，考虑实际生产成本，可将提取时间（C）由 3 次调整为 2 次。综合考虑，将工艺优化为 A3B3C2，即：黄连粗粉浸泡 30 min 后，用 12，10 倍量水提取 2 次，提取时间分别为 1.5 h。2.1.3 盐酸小檗碱的含量测定色谱条件：色谱柱为 Waters Symmetry ShieldTM RP18 柱（4.6 mm250 mm，5 m） ；流动相为乙腈-0.033 mol/L 磷酸二
9、氢钾溶液（3070） ；流速 0.8 ml/min；检测波长 345 nm；柱温 25；进样量 10 l。对照品溶液的制备及标准曲线的绘制：精密称取盐酸小檗碱5对照品 5.0 mg，置 10 ml 容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取 1 ml，置 10 ml 容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，配成 50 g/ml 的对照品溶液， 0.45 m 微孔滤膜过滤。分别精密吸取对照品溶液 2.0， 4.0，6.0，8.0，10.0 l，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 Y=4 936 700.000 0X40 780.000 0，r=0.999
10、 9，进样量在 0.100.50 g 范围内与峰面积呈良好线性关系。样品的测定：分别取上述 9 份供试液 10.0 l 进样，以与对照品相同的方法测定其峰面积，根据回归方程计算小檗碱的含量，并由此推算出各因素水平下提取液中盐酸小檗碱含量。2.2 多糖提取工艺的考察2.2.1 单因素实验方法与结果 称取黄芪等方中其余 4 味药共65 g，置于 1 000 ml 圆底烧瓶中，在其他条件相同的情况下，分别测定浸泡时间、料液比、提取时间和提取次数对提取效果的影响，以多糖含量为指标。浸泡时间的选择：固定条件：加 8 倍量水，冷凝回流 1 h，提取 1 次。设定的 5 个浸泡时间分别为 10，30，50
11、，70，90 min，按照“2.2.3”项下方法测定吸光度，计算多糖含量分别为3.780%，4.222%，3.987%，3.718%，3.483%。结果表明，随着6浸泡时间的延长，多糖得率逐渐增大，但在 30 min 时达到最大，时间再增加，由于杂质溶出增多，多糖得率反而降低。因此，浸泡时间以 30 min 为宜。料液比的选择：合适的料液比不仅影响有效成分的提取，对生产成本也是一个很大的影响因素。固定条件：药材浸泡 30 min，冷凝回流 1 h，提取 1 次，本实验考察的料液比水平的情况分别为16，18，110，112 和 114，得到其对应的多糖含量分别为 3.707%，4.166%，4.
12、973%，5.264%，5.477%。结果表明：随着料液比增加，多糖得率增加，但在料液比达到 110 之后，多糖得率增加缓慢，因此，为降低后处理中浓缩的负担，减少能量消耗，料液比以 110 为宜。提取时间的选择：固定条件：浸泡 30 min，加 10 倍量水，提取 1 次。考察提取时间分别为 0.5，1.0 ， 1.5，2.0，2.5 h 与提取效果的对应关系，得到的多糖含量分别为4.323%，4.939%，5.690%，5.936%，5.846%。结果表明：随着提取时间的延长，多糖得率逐渐增大，但在 1.5 h 时之后，多糖得率增加缓慢，在 2.5 h 时开始下降，这是由于杂质溶出增多，且多
13、糖容易糊化的结果。因此提取时间为 1.5 h 为宜。提取次数的选择：固定条件：浸泡 30 min，加 10 倍量水，7冷凝回流 1.5 h。考察提取次数从 1 次逐渐递增到 5 次与提取效果的对应关系，计算得多糖含量分别为5.723%，7.112%，7.773%，8.075%，8.243%。结果表明，随着提取次数的增加，多糖得率缓慢增加，但提取次数太多，会降低提取速率，增加成本和能耗，而且多糖的出膏率会很高，不利于颗粒剂的制备。因此，提取次数以 1 次为宜。由以上单因素实验结果可知，多糖的优选提取条件可确定为：浸泡 30 min，加 10 倍量水提取 1 次，提取时间为 1.5 h。2.2.2
14、 多糖的含量测定采用苯酚-硫酸比色法2 ，在 492 nm 波长处测定吸收度，计算多糖的含量。对照品溶液的制备及标准曲线的绘制：精密称取 105干燥至恒重的无水葡萄糖对照品 0.998 7 g，置 1 000 ml 容量瓶中加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（0.998 7 mg/ml） 。精密量取对照品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 ，5.0 ，6.0 ml，分别置 50 ml 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述溶液各 1 ml，置锥形瓶中，分别加入蒸馏水 2 ml，6.25%苯酚溶液 1 ml，混匀，迅速加入浓硫酸 5 ml，摇匀，倒入具塞试管中，置沸水浴加热 15 mi
15、n，取出，冷却至室温，以第 1 份为空白，在 492 nm 的波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖对照品浓度（C）为横坐标，8绘制标准曲线，得标准曲线方程为 A=0.006 9 C0.007 3，相关系数为 r=0.999 3，线性范围为 19.974119.844 g/ml。样品的测定：以上各单因素实验设计的多糖提取液离心后取上清液，将其定容至 1 000 ml，取样品 1 ml，置 50 ml 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取 1 ml，置锥形瓶中，分别加入蒸馏水 2 ml，6.25%苯酚溶液 1 ml，混匀，迅速加入浓硫酸 5 ml，摇匀，倒入具塞试管中，置沸水浴加热 15 m
16、in，取出，冷却至室温，在492 nm 处测定吸光度，计算总多糖含量。3 讨论本实验主要从保留方中有效降血糖成分的出发点进行研究，在提取过程中分别考察了盐酸小檗碱和多糖的浸出量，得出了优选提取工艺条件为：黄连与其余 4 味药分开提取；黄连粗粉浸泡 30 min 后，用 12，10 倍量水提取 2 次，提取时间均为 1.5 h；其余 4味药一起提取，浸泡 30 min，加 10 倍量水提取 1 次，提取时间为1.5 h。此外，考虑到糖尿病患者的“禁糖”要求，应将本方制成无糖型颗粒剂。后期实验采用醇沉法将多糖提取液进行适当精制，并且采用真空干燥法干燥多糖浸膏，可以大大减少辅料的用量，从而9减少服用量，符合无糖颗粒的一般特点。【参考文献】1 马超英黄连消渴汤治疗 2 型糖尿病 30 例临床报道J. 江西中医药，2004，35（12）：40.2 陈 强，吴春敏，胡 敏糖脂平胶囊提取工艺的研究J. 福建中医
