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1、分子生物学实验技术 及原理授课教师 马景蕃授课班级 05生技班05级 分子生物学实验 参考书目n 基因工程原理（上、下） 吴乃虎 n 现代分子生物学 朱玉贤 n 分子生物学 阎隆飞05级 分子生物学实验 实验一 大肠杆菌感受态制备 及转化05级 分子生物学实验 实验目的n1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中 的意义。n2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的 方法。n3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。 05级 分子生物学实验 实验原理n转化( Transformation )是将异源 DNA 分子 引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的 遗传性状的一种手段，它是
2、微生物遗传、 分子遗传、基因工程等研究的基本实验技 术。 05级 分子生物学实验 转化中的受体细胞n 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表 示。 05级 分子生物学实验 n转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化 学试剂法n感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透 性发生变化，成为能容许外源 DNA 分 子通过时细胞的状态。n转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( Transformant )。 实验原理05级 分子生物学实验 实验原理n本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl
3、2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携 带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质 粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符 号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适 应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养 ，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细 胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 05级 分子生物学实验 抗抗AmpAmp宿主细菌宿主细菌含含AmpAmp培养基培养基05级 分子生物学实验 影响转化率的因素 n细胞生长状态和密度。 n转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 n试剂的质量。 n防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 05级 分子
4、生物学实验 实验仪器 05级 分子生物学实验 超净工作台超净工作台05级 分子生物学实验 离心设备台式高速冷冻离心机05级 分子生物学实验 恒温空气摇床恒温空气摇床05级 分子生物学实验 恒温培养箱培养皿05级 分子生物学实验 实验试剂v 大肠杆菌DH5v LB培养基，v 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）v 氨苄青霉素v pUC18质粒 05级 分子生物学实验 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化05级 分子生物学实验 实验步骤 菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB 培养基平板表面划线，于37培养16小时 2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中， 于3
5、7培养35小时 3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23 小时，到OD6000.30.405级 分子生物学实验 实验步骤 感受态细胞制备 4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15 30min 54000rpm离心5min,弃上清 6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预 冷10min 74000rpm离心5 min,弃上清 8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使 用。也可加入总体积15的甘油 可70长期保 存05级 分子生物学实验 实验步骤 转化 9 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于 冰上放置30min 10 于
6、42水浴90S 11 冰上放置2min 12 加入800lLB液体培养基于37培养1小时 13 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14 将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个 小时，然后观察结果05级 分子生物学实验 对照组对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况 下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗 生素的LB平板上，此组正常情况下应产 生大 量菌落。05级 分子生物学实验 转化率统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转
7、化子，根 据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如 下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积 涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数 质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总 体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 05级 分子生物学实验 实验结果05级 分子生物学实验 实验报告n写明实验目的、实验原理、仪器、材料与 试剂n详细列出实验步骤；n画出实验结果的示意图并做分析，计算转 化效率。05级 分子生物学实验 实验二 质粒DNA的提 取及酶切05级 分子生物学实验 一实验目的及背景n质粒是染色体外的DN
8、A分子，大小可为1kb 到200kb。n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。n其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。05级 分子生物学实验 质粒特点n质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细 胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命 。n质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移 到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.n年由Lederburg正式命名为质粒。05级 分子生物学实验 质粒类型n质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 和 严紧型质粒n1.松弛型质粒松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功 能蛋白，完全依赖于宿主
9、提供的半衰期较 长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的 复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断 细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时 ，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。05级 分子生物学实验 2.严紧型质粒n严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白 ，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白 合成抑制剂来增加。05级 分子生物学实验 质粒的应用n大多数基因工程使用松弛型质粒。n严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受 毒害致死的基因。n质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入 细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工程中具有极广泛的应 用价值。05级 分子生物学实验 本实验目的n本实验要求掌
10、握最常用的质粒的提取方法 。05级 分子生物学实验 分离质粒DNA方法n从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用 的n碱变性法；n煮沸法；nSDS法；n 羟基磷灰石层析法等n各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小 、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变 性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于 酶切,连接与转化。05级 分子生物学实验 碱变性法基本原理n在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然 状态。n将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色 体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分 DNA和蛋白质在去污剂
11、SDS的作用下形成沉淀， 而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部 分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒 DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质 粒DNA。05级 分子生物学实验 实验试剂n培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5 NaCl 10gn： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTAn 50mg/mln溶菌酶 10mg/ml (用10mM TrisHCl pH8.0新鲜配制）05级 分子生物学实验 试剂n溶液： 50mM 葡萄糖 25mM TrisHCl（pH8.0） 10mM EDTA
12、n溶液：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDSn溶液： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5mln酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖n： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA05级 分子生物学实验 pUC18链长2,686 bp pUC18是适合于双脱氧法DNA测序的 载体，在lacZ领域中含有多克隆位点 ，因此在含有IPTG， X-Gal的平板培 养基上，很容易判断有无外源基因的插入。此外，也可以利用lac promoter 表达外源基因。进行DNA测序时， 可以很方便地使用M13系列Primers。05级 分子生物学实验 pUC18n多克
13、隆位点：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I 和 Hind III 只有一个酶切位点。 n n用途n克隆外源基因。 n利用lac promoter进行基因表达。 n使用M13 primers进行DNA测序。 npUC18/pUC19 cloning site05级 分子生物学实验 三实验方法n挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含 AmP 50g/ml）， 强烈摇荡过度。n取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒， 弃上清，用ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重
14、复 一次，弃上清，取沉淀。n将细菌沉淀悬浮于100l预冷溶液中，振荡混匀， 冰上放置5分钟。n加入200l溶液，盖严管盖轻柔颠倒次以混匀内 容物，冰上放置5分钟。n加入150l溶液，温和振荡数次，冰上放置分钟 。n12000g 4 离心分钟，取上清移到个新的 Eppendorf管中。05级 分子生物学实验 n(加入等体积酚/氯仿（：），振荡混匀，12000g 4 离心分钟。取上清移至另个Eppendorf管中。)n加入倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分 钟。n g ,4 离心分钟。n弃上清，加入ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠 倒数次，000g 于4 离心分钟。n弃上清，抽干乙醇，室
15、温干燥（5-15分钟）。n加入50l TE（含20g/ml RNA 酶，不含DNA酶） 溶解DNA。05级 分子生物学实验 13取10l DNA溶解液用稀释至1000ul测定 OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比； 14. 同时以以下公式计算得率。 质粒DNA得率： 稀释倍数OD2600.0550/1.5ml 15取10l DNA溶解液加2l Loading buffer于1%琼 脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结 果。05级 分子生物学实验 四结果分析n质粒DNA OD260,OD280的值，由此计 算质粒DNA得率和纯度。n记录电泳结果并说明结果内容。05级 分子生物学实验 问题与讨论：n简要叙述溶液、溶液和溶液的 作用，以及实验中 分别加入上述溶液后， 反应体系出现的现象及其成因。n简要叙述酚氯仿抽提体系后出 现的现象及其成因。n3. 沉淀时为什么要用无水乙醇及在 高盐、低温条件下进行？05级 分子生物学实验 实验三 琼脂糖凝胶
