免疫组化原理及流程介绍

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1、免疫组化的原理及流程介绍 主要内容免疫组化原理及流程介绍一.免疫组化的发展简史二.免疫组化的原理三.免疫组化的基本流程四.免疫组化的结果分析免疫组化原理及流程介绍一.发展简史1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术铁蛋白 标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根 过氧化物酶抗体过氧化物酶（PAP）技术， 使免疫细胞化学得到广泛应用。80年代 Hsu 等建立了抗生物素生素（ ABC）法之后，免疫金银染色法、半抗原 标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免

2、疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应该掌握的基本技术之一。免疫组化原理及流程介绍二 免疫组化的原理免疫组织化学又称免疫细胞化学 ，是指带显色剂标记的特异性抗体在 组织细胞原位通过抗原抗体反应和组 织化学的呈色反应，对相应抗原进行 定性、定位、定量测定的一项新技术 。免疫组化原理及流程介绍它把免疫反应的特异性、组织化学的 可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包 括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放 大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种 抗原物

3、质(如蛋白质、多肽、酶、激素、 病原体以及受体等)。 三 免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化2.细胞通透、封 闭内源性过氧化 物酶 3.抗原修复、暴 露抗原决定簇 4.封闭非特异性 蛋白 5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应 8.显色 9.复染、脱水 、透明、封片 2.细胞通透、封 闭内源性过氧化 物酶 免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化脱蜡与水化的目的是确保抗体等其 他试剂能够充分与组织中抗原等结合发 生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶 性反应和浸洗不全，而产生非特异性背 景着色。1)60 20 minXylene：2 10 minutes； 2)100% abs

4、olute ethanol： 2 5 minutes；3)95% ethanol 2 minutes； 4)80% ethanol 2 minutes； 5)70% ethanol 2 minutes；6)distilled water:5 min；7)PBS 洗 3 3 min。 具 体 操 作免疫组化原理及流程介绍2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶目的是使抗体能够充分地进入胞内 进行结合反应。一般用Triton X-100、 蛋白酶k等通透液。(1)细胞通透免疫组化原理及流程介绍(2)封闭内源性过氧化酶其主要目的是降低内源性过氧 化物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容

5、易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。 1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光 ）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次3 min。 免疫组化原理及流程介绍具体操作:免疫组化原理及流程介绍3. 抗原修复 暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多 聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间 交联及醛基的封闭作用，从而失去抗 原性；通过抗原修复，使得细胞内抗 原决定簇重新暴露，提高抗原检测率 。 免疫组化原理及流程介绍常用的修复方法从强到弱一般 分为三

6、种，高压修复、微波修复、 胰酶修复。 抗原修复的主要方法:酶消化方法 一般用于细 胞内抗原应用高频电磁波 打开蛋白质间的 交联键免疫组化原理及流程介绍将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。 2)PBS 溶液洗 3 次3 min。具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍4.封闭特异性蛋白组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有交叉反应的位点发生结合

7、。 免疫组化原理及流程介绍将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化 笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊 血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 ( 约30)下1030min。 具体操作：大一点免疫组化原理及流程介绍5.一抗孵育一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要 ，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度 ，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、 抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜 和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还 要摸索。 免疫组化原理及

8、流程介绍1.防止脱片；2.使抗原 抗体结合更稳定。甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织 周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1 ：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 复温 45 min。 免疫组化原理及流程介绍具体做法：免疫组化原理及流程介绍6.二抗孵育二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团），作用是检测一抗 。 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度 30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度 和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和 孵育时间。 免疫组化原理及流

9、程介绍1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已 稀释的二抗后放入 37恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次5 min 免疫组化原理及流程介绍具体操作：7.SP反应SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。该法是ABC法基础上的进一步改良 ，使卵白素与链霉（而非生物素）结合 ，而后再结合PO基。免疫组化原理及流程介绍1） 加入 SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2） 用 PBS 洗 5 次5 min。具体操作：SP染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。免疫组化原理及流程介绍8.显色在免疫组化中，由于抗原

10、抗体所 形成的复合物本身没有颜色，不能 直接观察，只能借助于其他某些化 学基团的显色作用，是复合物显色 ，有利于显微镜下观察。免疫组化原理及流程介绍通常在过氧化物酶（HRP）法中，显 色剂为DAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)配法:DAB 50mg0.05M TB 100ml30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫组化原理及流程介绍9、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好 地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏 木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸 酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水 振洗，在放入氨水中返蓝即可。 1) 用 PBS 3 次3

11、min 后，用双蒸水洗 5 min；加 一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜 蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再 用 PBS 返蓝 5 min。 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 3) 透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 封

12、片：中性树胶。 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四 免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则 ：1.必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达 。免疫组化原理及流程介绍实验分析的相关介绍阳性对照：阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待用已知抗原阳性的切片与待 检标本同时进行免疫细胞化学染检标本同时进行免疫细胞化学染 色。对照切片呈阳性结果，标为色。对照切片呈阳性结果，标为 阳性对照。阳性对照。用确证不含已知抗原的标本作对用确证不含已知抗原的标本作对 照，应呈阴性结果，称阴性对照。其照，应呈阴性结果，称阴性对照。其 实这只是阴性对照中的一种，阴性对实这只是阴性对

13、照中的一种，阴性对 照还应包括空白、替代、吸收和抑制照还应包括空白、替代、吸收和抑制 实验。实验。阴性对照：免疫组化原理及流程介绍阳阳 性性 对对 照照阴阴 性性 对对 照照替替 代代 对对 照照实实 验验 组组结论结论1 1操作错误操作错误2 2非特异性反应非特异性反应3 3阴性对照含定位阴性对照含定位 AgAg4 4阴性对照不含定阴性对照不含定 位位AgAg5 5受检组织非特异受检组织非特异 性染色性染色6 6受检组织不含定受检组织不含定 位位AgAg7 7受检组织含定位受检组织含定位 AgAg免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化原理及流程介绍 从表上可以看出，只有从表上可以看出，

14、只有6 6，7 7实验结果有实验结果有 意义。意义。1 15 5均因对照组的结果已否定均因对照组的结果已否定AbAb 的特异性或因的特异性或因IHCIHC技术操作存在错误等而技术操作存在错误等而 使实验结果失去意义，必须重复实验或使实验结果失去意义，必须重复实验或 换用换用 AbAb. . 阳性 对照阴性 对照替代 对照实验 组结论6受检组织不含 定位Ag 7受检组织含定 位Ag免疫组化原理及流程介绍1 1阳性染色特点阳性染色特点 AgAg定位，胞浆、胞核、胞膜、间质定位，胞浆、胞核、胞膜、间质 具有结构性。（非特异性染色具有结构性。（非特异性染色 细胞与细胞与 组织无区别）组织无区别） 染色

15、强度不同：颜色深浅不一（非染色强度不同：颜色深浅不一（非 特异性染色特异性染色 弥散性均匀）。弥散性均匀）。除上述对照结果分析之外，还必除上述对照结果分析之外，还必 须从以下几个方面综合评价：须从以下几个方面综合评价：2 2组织切片制作过程的影响组织切片制作过程的影响 固定不良固定不良非特异性染色，显示不均非特异性染色，显示不均 。 边缘干燥边缘干燥非特异性染色（常见），非特异性染色（常见）， 加抗体时勿干片。加抗体时勿干片。免疫组化原理及流程介绍3 3人工假象与特异性结果显示不在同一人工假象与特异性结果显示不在同一 平平 面上。面上。免疫组化原理及流程介绍染色失败的几种原因：(1)(1)所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。染 色 失 败 的 可 能 情 况(2)(2)所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应(3)(3)所有切片背景过深所有切片背景过深(4)(4)阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应阳性标本呈阴性反应免疫组化原理及流程介绍(1) 所有切片呈阴性1 1）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行2 2）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性