基因为靶点的肿瘤

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1、p53基因联合放射治疗肝癌的基础 与临床研究研究单位：第三军医大学第三附属医院研究人员：王东、金丰、杨志祥、张沁宏张新立 、李增鹏、王阁、谢家印n 2002年全球新发病例 626,162n 中国病例占55，约344,000瘤种新发病例 （万）排 名死亡病例 （万）排 名肺癌135.01118.01乳腺癌115.0241.15结直肠癌100.0352.94胃癌93.4470.02前列腺癌67.9522.16肝癌*62.6659.83nHCC是全球第六位最常见恶性肿瘤n第三位最常见肿瘤相关性死亡原因研究背景肝癌治疗现疗现 状HCC 分期早期2 BCLC A中期3 BCLC B晚期3 BCLC C终

2、终末期 BCLC D自然病程5年生存率20%*16月6月3-4月 治疗疗手段手术术TACETACE? 消融术术、放疗疗？放疗疗索拉菲尼索拉菲尼 治疗疗效果5YOS 40-70% 5Y复发发70%MTS20月MTS 10.7月n 化疗药物具有普遍耐药性，随机对照试验尚未显示化疗的生存获益n 放疗成为有效的治疗手段，但由于正常肝组织耐受量低，疗效有限n迫切需要新的技术和药物提高肝癌放疗的有效性更高的有效率;更低的毒副作用;更多的选择方案放射治疗肿瘤抑制基因P531979:discovery2004:cancer therapy GendicineGendicine 中国 Sibiono25 年n局

3、部瘤内注射n对多种实体瘤有效n单独p53基因治疗效果有限l细胞凋亡抑制 l细胞周期阻滞 l肿瘤内低氧 l肿瘤血管生成P53放疗敏感性WTP53联合放疗目的和意义本项目从临床病理、分子流行病学、体外体内实验，以及临床研究，系统地研究了以p53为靶点的基因治疗联合放疗治疗肝癌的可行性和有效性，为临床治疗肝癌提供了一个全新的技术和方法。一.重庆地区人原发性肝癌p53基因突变np53基因是否为肝癌的潜在治疗靶基因np53基因突变是肝癌发生发展的早期事件/晚期事件np53基因突变与AF污染和HBV感染之间的关系PCR检测249突变PCR-SSCP检测7外显子突变地高辛标记探针Southern blotA

4、RF免疫组化p53蛋白阳性43.8%； 249位密码子点突变18.4%；第7外显子点突变2/31； p53基因位点PYNZZZ杂合性缺失(16.7%）P53突变与HCC临床病理的关系分类例数P53阳性P53阴性P 值肿瘤体积3cm11743-5cm195140.055cm502327Edmondso分级级413级3310230.05实体型22814硬化型422PCNA标记指数42.6%27.1%0.05阴性17512n与肝癌的转移显著相关, 是HCC低分化、高侵袭的重要因素nP53突变仅见于肝癌组织，提示p53基因改变发生在肝癌启动阶段之后。nP53突变与HCC大小无关，提示p53突变在肝癌发

5、生早期业已存在。np53 249位突变主要见于体积大的HCC。提出散发型p53基因突变可能发生于HCC的早期，而249密码子特异性突变则主要是HCC的晚期事件。p53基因突变与肝癌病因学的关系我们将p53基因突变可分为249位特异型突变和散发特异性 突变两种类型。进一步提出HBV和AF在p53基因突变和 HCC发生中具有协同作用，其中AF主要与249位特异性突 变有关，而HBV则可能在散发型突变中发挥主要作用。重庆地区p53基因突变在DEN诱导大鼠肝癌中的研究在EDN诱发的肝癌模型中仅见癌前个别肝细胞增生结节P53阳性,8/18例(44.44%)肝细胞癌呈P53阳性,表明P53基因突变可发生于

6、大鼠肝癌变之癌前及肝癌形成阶段二.重组人p53腺病毒（Ad-p53）增强肝 癌放疗敏感性的实验研究50MOI的Ad-EGFP感染肝癌细胞48h后EGFP表达情况(200)rAd-p53感染肝癌细胞后P53蛋白的表达情况n249 Mtp53肝癌 细胞PLC/PRF/5 nWTp53肝癌细 胞SMMC-7721SMMC-7721细胞 PLC/PRF/5细胞rAd-p53感染肝癌细胞48h后联合放疗细胞存活曲线rAd-p53转染后加照射PLC/PRF/5和SMMC-7721 细胞的放射增敏比SERDq 值分别为1.43和1.06。细胞存活率分别为3.41%和35.44%，细胞生长抑制率分别为41.9

7、1%和17.03%.n SMMC-7721 n 近交系BALB/c nu/nu无胸 腺裸小鼠18只012345678910111213141516瘤内多点注射0.1ml（ 2108pfu） rAd-p53放疗照射5Gy/次n 分组：对照组单独放疗组rAd-p53治疗组rAd-p53放疗实验治疗方案Ad-p53增强肝癌放疗敏感性的动物实验组别数量体积（mm3， s）抑瘤率（%）对照组41197.06125.73单独放疗组4843.1215.7330.74rAd-p53治疗组4815.4625.2833.67rAd-p53IR联合组4263.0619.9081.49*三.rAd-p53增强肝癌放疗

8、敏感性的临床研究rAd5-p53联合SRT治疗早期肝癌n 20042007年病理诊断的早期HCC40例n 随机分为SRT组和rAd-p53联合SRT组n 患者拒绝手术并签署知情同意书n 肿瘤直径为2cm5.2cm，中位3.2cmn SRT总吸收剂量50Gy/10f/2w。n Ad-p53 经B超引导下经皮瘤内注射。n 参照WHO实体瘤疗效标准评估。n 随访期为11月44月（中位35月）Grpoups fSRT rAd5+fSRT Number 20 20 Gender Male5 4 Female1516 Age 527.9 548.6 Tumor Size 3.610.86 3.450.97

9、 KPS 012 13 176 211 AFP 40013 11 40079 HBV Positive18 17 Negative23GroupsTreatment outcomesCRPRSDPDRR(%)fSRT4/2010/206/200/2014/20(70)Combine d7/2010/203/200/2017/20(85）n联合组和放疗组1年总生存率 和无病生存率分别为90.0% 、 70.0%和85.0%、65.0% nMTS分别为33月和20月。n全组患者均可耐受治疗，未出 现级以上毒副反应。SRT alone / SRT combined p53Toxicity grade

10、1 2 3 4Gastrointestinal6/6 4/6 0/0 0/0Liver 4/5 3/3 0/0 0/0Thrombocytopeni a3/4 3/4 0/0 0/0Leukopenia2/1 1/2 0/0 0/020 %影响预后指标的Cox回归模型分析358例肝癌预预后因素 B SE Wald df Sig. Exp(B)95.0% CI for Exp(B)LowerUpper 瘤数目.197.1332.2031.1381.218.9391.580最大径.478.11018.9281.0001.6121.3001.999门门脉受侵.293.1464.0031.0451.3

11、411.0061.786Child分级级.254.1244.1531.0421.2891.0101.645AFP.153.1351.2801.2581.166.8941.520体质评质评 分.195.1511.6651.1971.215.9041.633临临床分期.205.0669.6431.0021.2281.0791.398rAd5-p53联合SRT治疗晚期肝癌不同治疗模式肝癌生存率比较治疗疗模式病例数 (%)1年生存率2年生存率3年生存率中位生存时间时间 （月） (95% CI)P值值中位最小值值最大值值支持治疗疗51(14.25)38.0018.506.208.0005.89710.1

12、03-TACE 27(7.54)50.20 41.80 16.70 12.000 5.322 14.678 0.418SRT184(51.40)49.60 16.20 7.70 11.000 9.835 12.165 0.376TACE联联合 SRT37(10.34)74.30 36.80 19.50 17.000 10.051 23.949 0.027SRT联联合 CT41(11.45)85.0034.805.3018.00016.52019.4800.027p53 联联合C/RT18(5.03)88.9045.7026.1022.00013.27830.7220.008表明rAd-p53联

13、合放射治疗肝癌安全有效，患者耐受性 好，副作用小，项目创新点1. 在国内首先建立了ARF-微波修复P53蛋白免疫组化方法。2. 从分子流行病学揭示了p53改变是本地区HCC的重要特点，明确将P53突变分为249密码特异型突变和散发型突变，并提出AFB1主要引起P53特异型突变，而HBV在P53散发型突变中起主要作用。3. 将基因治疗和放疗相结合，通过体外体内实验证明了rAd-p53联合放疗能显著提高肝癌细胞的放疗敏感性。4. 以基础研究的结果指导临床，应用rAd-p53联合放射治疗肝癌，进一步证明了联合治疗不论肿瘤局控率还是患者的生存时间都显著优于单独放疗。推广应用发表论文34篇, 大会交流1

14、2篇金丰，杨志祥，王东 等。内科综合治疗358例肝癌多因素预后分析。临床肿瘤学杂志，2009 曹晓静，戴楠，杨志祥，金丰，仲召阳，王阁，王东（通讯作者）。重组人p53腺病毒治疗原发 性肝癌的血清p53蛋白检测及其临床意义。肿瘤预防与治疗，2009，22（1）：5-8。 王东 杨志祥 张沁宏 等。重组人p53腺病毒（今又生）联合化疗、放疗治疗晚期恶性肿瘤的临床 观察。临床肿瘤学杂志，2008,13(10):896-900. 张沁宏，向德兵，卿毅 等。重组人p53腺病毒增强肝癌细胞放疗敏感性的实验研究。中国生物治 疗杂志，2008,15(5):458-463 杨志祥，王阁，王东等。立体定向放射治疗

15、肝转移癌临床疗效观察。重庆医学，2007；36（19 ）：1953-1954。 张沁宏, 王东, 牟江洪 等 重组腺病毒介导的p53基因对肝癌细胞生长抑制作用的研究。第三军医 大学学报，2006；28（2）：121-124。 张新立，史景泉，卞修武。大鼠肝癌变中p53点突变及其蛋白表达的研究。第三军医大学学报， 2001，23（8）：885-887。 Wang Dong 王东, Shin Jingquan 史景泉, Liu Fengxuan 柳凤轩. Immunohistochenical study of P53 protein expression in human hepatocellular carcinoma. J Med Coll PLA, 1996;11(1):30-33. Wang Dong 王东, Shin Jingquan 史景泉. Overexpression and mutations of tumor suppressor gene P53 in hepatocellular carcinoma. China Natl