7第七章酶非水相催化

《7第七章酶非水相催化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《7第七章酶非水相催化（87页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第七章 酶非水相催化观念的改 变l有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化 反应建立起来的。l近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶 作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶 学（non-aqueous enzymology)。第一节 酶非水相催化的研究概 况受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同 。 酶的非水相催化主要 包括:一、有机介质中的酶催化； 二、气相介质中的酶催化； 三、超临界流体介质中的酶催化； 四、离子液介质中的酶催化一、有机介质中的酶催 化l指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化 反应。l适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性物 质的酶催化作用。l原因:酶在有机介质

2、中基本能保持结构的完整 。l特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选 择性、键选择性、热稳定性等有所改变。l应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合 成、手性药物拆分的研究。二、气相介质中的酶催 化l指酶在气相介质中进行的催化反应。l适用范围：底物是气体或能转化为气体 的物质的酶催化反应。l特性：气体介质的密度低，扩散容易， 与在水相中明显不同。三、超临界流体介质中的酶 催化酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质的超临界 点的流体。 要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良 好化学稳定性；温度不可太高太低；压力 不可太高；易获得等。 常用的超临界流体有：CO2, SO2

3、 C2H4, C2H6 C3H8 C4H10 等。四、离子液介质中的酶催化l指酶在离子液中进行的催化作用。l离子液 (Ionic liquid )是由有机阳离子与有机（无机 ）阴离子构成的、在室温下呈液态的低熔点盐类 ，挥发性低，稳定性好。l特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性 、立体选择性、键选择性。第二节 有机介质中水和有机溶剂 对酶催化反应的影响1、微水介质体系； 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系； 3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 4、（正）胶束体系； 5、反胶束体系。一、有机介质反应体系1、微水介质体 系 l是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系 。l微量的水主要是酶

4、分子的结合水,对维持酶 分子空间构象和催化活性至关重要。l另一部分水分配在有机溶剂中。l酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机 介质中，是常见的有机反应体系。2、与水溶性有机溶剂组成的均一 体系l由水与极性较大的有机溶剂互相混溶组 成的反应体系。l水与有机剂含量均较大。l适用的酶较少。3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体 系l由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反 应体系；l游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底 物或产物溶解于有机溶剂相。l固定化酶在界面；l催化反应在两相界面进行；l适于底物或产物两者或其中一种属于疏水化合物的 催化反应。4、正胶束体系大量水溶液中含有少量与水不

5、相混溶的有机溶剂， 加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂被 包在液滴内部。酶在胶束外面的水溶液中,疏水性的底物或产物在胶 束内部,反应在胶束的两相界面中进行。5、反胶束体系l反胶束: 在与水不互溶的大量有机溶剂中,加入表面活性剂后形 成的油包水的微小水滴；l1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；l酶分子处在反胶束内，稳定性好；l反胶束与生物膜有相似之处，适用于处在生物膜表面或与膜结合 的酶的结构、催化特性和动力学性质的研究。二、水对有机介质中酶催化的影 响l有机溶剂中酶的催化活力与反应系统的含水量 密切相关。l系统含水量

6、:结合水(酶粉水合、固定载体和其 他杂质)、游离水(溶于有机溶剂)l与酶结合的水量是影响酶的活力、稳定性以及 专一性的决定因素1、水对酶分子空间构象的 影响l无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层;l必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最 低水量;l不同的酶所需求的必需水的量差别较大;l每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多 酚氧化酶却需3.5102个水分子l原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键 等副键所必需的。2.水对酶催化反应速度的影响 l典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其 微小差距会导致酶催化活力的较大改变。l水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和 稳定性。三

7、、有机溶剂对有机介质中酶催化的影 响l直接或间接影响酶的活性和稳定性。l改变酶的特异性（底物特异性、立体选择性 、前手性选择性等）。l通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影 响酶的特性。1. 有机溶剂对酶结构与功能的影 响在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好 地保持其构象； 有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分 子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持 也有不同。 有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏； 有的酶分子则保持完整；（1）有机溶剂对结合水的 影响l一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶 表面的必需水而导致酶失活。l由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适 含水量与酶的用量及底物

8、浓度有关。l提高酶分子的亲水性，可以限制酶在有 机溶剂中的脱水作用。2. 有机溶剂对酶活性的 影响、溶剂对底物和产物分配的 影响l溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用 。l溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的 浓度。有机溶剂极性小，疏水性强，则疏水性底物 难于进入必需水层；有机溶剂极性过强，亲水性强，则疏水性底 物在有机溶剂中的溶解度低。 故选择2lgp5的有机溶剂作为有机介质为宜 。第三节 酶在有机介质中的催化特 性l有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精 细平衡,从而影响到酶的结合部位。l有机溶剂会改变底物存在状态。l结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立 体选择性,区域选择性和化学键

9、选择性。2、底物特异性 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和 立体结构均有严格的选择性。例如：青霉脂肪酶 在正己烷中催化2-辛醇与不同链长的脂 肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具 有较强的特异性。一、底物专一性(1)有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态 发生改变,致使酶的底物特异性发生改变:l水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用;l有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;(2)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样:l极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反应;l极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反应;3、对映体选择性 酶的对映体选择性是指酶识别外消旋 化合物中某种构象对映体的

10、能力。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性 由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变 。疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差。例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合 成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L- 氨基酸。 二、对映体选择性（ enantioselectivity)对映体选择性意义：例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以 合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只 选择L-氨基酸。 三、区域选择性（ regioselectivity） 酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发 生反应；用区域选择系数的大小衡量。 用1、2代表底物分子的区域位置； 区域选择系数：K1，2=（kcat/Km)1/

11、 （kcat/Km)2例：1,4-二丁酰基-2-辛基苯丁醇脂肪酶转脂反应+甲苯乙腈K4，1 20.5四、键选择性（ chemoselectivity)l即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶 反应，酶对其一优先反应。6-氨基-1-已醇黑曲霉脂肪酶毛霉脂肪酶羟基酰化氨基酰化占优五、热稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比 水溶液中高。 例如： 猪胰脂肪酶（PPL）在苯中催化酯交换反 应时， （1）酶活性随温度升高（2070）而增加， （2）在70连续反应7次（每次96 h）后酶活力仍 保持 60， （3）在100时的半衰期可达数十小时，而在水 中100几乎马上失活。PPL的稳定性取决于有

12、机溶剂中水的浓度， 1的水，会使PPL的稳定性降低到和水溶液中相 同的水平。 六、pH值特 性l在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸 附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为 pH印记或pH记忆（pH-imprinting）;l现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯 反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的 PH密切相关，反应的最适PH接近于水溶液中的最 适PHl原因：当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原 有的解离状态不变，被保持在有机介质中；l有机介质中酶催化反应的最适ph通常与在水溶液 的pH接近；l但有些有机溶剂中酶的最PH与水溶液中相差较大 ，还与缓冲液种类和离子强度有关

13、;第四节 有机介质中酶催化反应的 条件及其控制l酶在有机介质中的催化反应受各种因素影响， 主要有酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度 、pH值和离子强度等。一、有机介质中酶催化反应的类 型1、合成反应2、转移反应3、醇解反应4、氨解反应5、异构反应6、氧化还原反应7、裂合反应1、合成反 应 有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反应； （1）脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反应：意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主 要是选择立体异构的醇。（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进 行合成反应，生成多肽2、转移 反应l如脂肪酸催化酯与有机酸反应生成另一种酯与有机酸, 即转酯

14、反应：3、醇解 反应l假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物即酸酐水解反应,例:4、氨解 反应如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：R-苯丙氨酸甲酯酰胺叔丁醇5、异构反 应l如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体例6、氧化还原 反应（1）单加氧（2）双加氧（3）催化醛类或酮类还原成醇类（1）单加 氧（2）双 加氧（3）催化醛类或酮类还原成 醇类7、裂合 反应l如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应二、酶的选择1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源 、处理法不同特性亦有差别； 2、酶反应速度与酶浓度成正比； 3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择 性、区域选择性、键选择性等三、底物的选择和浓度控

15、制1、有机剂与水中酶的底物专一性不同； 2、底物浓度对酶催化速度有明显的影响； 3、有机介质中要考虑底物在有机溶剂和必 需水层中的分配情况； 4、高浓度底物会对反应产生不利影响。四、有机溶剂的选择l1、有机剂的极性要选择恰当：l极性过强,夺取较多酶表面水分子,使疏水性 底物溶解度降低;l极性过弱,底物难以进入必需水层;l故取中间:2lgP5l2、与水混溶的有机介质其含量对酶催化有影响。l与水混溶的二氧六环介质,辣根过氧化酶(HRP)催化对 苯基苯酚的聚合反应,随着二氧六环的含量增加,酶催化 得到的聚合物的分子量也增加,80%时最大。二氧六环含量/%聚合物相对分子质 量五、含水量的控 制当其它因

16、素不变时，系统含水量对酶活性有影响， 只有在最适含水量时酶才有最高活力； 最适水含量通常随溶剂极性增大（lgP减小）而增大 ；1水含量反应速度21 3 41-已烷2-四氯甲烷3-甲苯4-苯六、温度的控 制1、微水有机介质中含水量低，酶的热稳定性增强 ，其最适温度高于水溶液中催化的最适温度； 2、温度低，酶的立体选择性高。Lam和Keinan的实 验结果支持此结论；七、pH值的控制l酶在有机介质中的最适PH值通常与在水溶液中催化的最 适pH相同或接近；l可通过调节缓冲液pH的方法调节有机介质中酶催化的pH 值；l酶在冷冻干燥过程中，pH状态有变化；l希令（hilling)发现缓冲液对冷冻干燥过程中pH值和酶 活力有影响，故加入一定量的蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保 护剂；l在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施；l加有机相缓冲液可对有机介质中酶反应的pH调节。第五节 酶非水相催化的应用酶 催化反应 应用脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽 合成酯合成 醇与有机酸合 成酯类聚合