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1、1、免疫微粒 以某种高分子有机单体为原料，制备成一定粒度大 小的固相微粒。采用物理吸附、化学偶联及生物素- 亲合素桥联法等方法，使制备好的微粒与抗原或抗 体结合而成为免疫微粒。n微粒种类：四大类，数量多达几十种 惰性微粒（如聚苯乙烯胶乳微粒） 活性微粒（如羧化聚苯乙烯微粒） 磁性微粒 标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)。亲和技术和放大技术Date1亲和技术和放大技术 1、免疫微粒n免疫微粒技术应用 用于免疫学及其他生物学检测与分离技术。 （1）胶乳免疫测定法(Latex immunoassay，LIA)基本原理 n致敏胶乳微粒+待测抗原胶乳微粒凝集测定方法 主要有粒子计数法和浊度法两种。特点
2、 LIA是一种非放射性均相免疫测定法，可以对 各种微量的抗原物质和小分子半抗原(如药物、甾体 激素等)进行精确的定量测定。Date2亲和技术和放大技术 1、免疫微粒n免疫微粒技术应用 （2）微粒固相免疫法 微粒固相免疫测定法原理 免疫微粒 + 可溶性Ag +荧光素-Ab测定荧光强度 特异性Ab包被 待测技术特点 敏感性极高应用 用于测定体液中的多种微量物质。 用于放射免疫测定中游离抗原（F）与结合抗原（B） 的分离 Date3亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素生物学特征 （1）生物素（biotin，B）（辅酶R或维生素H）n小分子，结构简单，有和 两型，生物活性基本
3、相同。生物素有两个环状结构， 环为咪唑酮环，是与亲合素结 合的主要部位；环为噻吩环 ，其C2上戊酸侧链的末端羧基 是结合抗体和其他生物大分子 的唯一结构。Date4亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素生物学特征 （2）亲合素（avidin ，A） （抗生物素蛋白、卵白 素或亲和素） 碱性大分子糖蛋白，由4个相同亚基组成。 富含色氨酸（约占6），藉助色氨酸残基与生物素的咪唑酮 环结合。 易溶于水，在pH913的溶液中保持稳定；耐热， 耐多种酶 ，和生物素结合后十分稳定。 亲合素可直接偶联各种标记物，特别是生物素。 与生物素的亲和力极强，具有高度特异性。结合高度稳定。Da
4、te5亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素生物学特征 （3）链霉亲合素（streptavidin，SA） n SA是链霉菌在培养过程中分泌的一种产物，分子量 65kDa，由4条序列相同的肽链组成。nSA 的pI为6.0，不含糖基，是一种稍偏酸性的蛋白质 。一个SA分子也能结合4个生物素分子。nSA在检测应用中出现的非特异性结合远低于亲合素 ，故而有日渐取代后者之势。Date6亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素系统BAS)的试验方法和原理 基本原理 （Ag/Ab）-多个生物素亲合素4分子生物素 抗原或抗体分子可偶联多个生物素，后者再结合 亲和
5、素，以1分子亲和素可结合4分子生物素，组成 生物放大系统Date7亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素系统BAS)的试验方法和原理 基本方法 BAS系统基本方法：主要有三种。 （1）亲合素-标记生物素桥联法（BRAB法或BAB法 （2）标记亲合素-生物素法（LAB法或BA法） （3）亲合素-酶标生物素复合物技术（ABC法）抗生物素和抗亲合素抗体标记法。Date8亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素系统BAS)的试验方法和原理 （1）亲合素-标记生物素桥联法 （BAB法或BRAB法) 包被抗体 + 待测抗原 + Ab-B + SA + B-酶
6、+底物以游离的亲合素作为桥臂居中，将生物素化抗体 和标记生物素（如酶标生物素）联结起来，将使大量 酶分子积聚于复合物周围；然后加相应底物，即会产 生强烈的酶促反应，故可提高检测的灵敏度。Date9亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素系统BAS)的试验方法和原理 （2） 标记亲合素-生物素技术（BA法或LAB法） 包被抗体 + 待测抗原 + Ab-B +SA-HRP + 底物 以酶标亲合素（或链霉亲合素）直接联结生物素 化抗体。间接BA法采用生物素化的第二抗体，可以 进一步提高检测灵敏度。 但BA法中亲合素与酶的共 价偶合过程，对酶活性能引起一定程度的损伤。Date10
7、亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n生物素与亲合素系统BAS)的试验方法和原理 （3）亲合素-酶标生物素复合物技术 （ABC法或SABC法）BAB法的改良 包被抗体 + 待测抗原 + Ab-B +ABC + 底物 先制备可溶性的亲合素（或链霉亲合素）-生物素- 过氧化物酶复合物（ABC orSABC）。当其与生物素化 一抗（直接法）或二抗（间接法）相遇时，ABC（或 SABC）中A（或SA）未饱和的结合部位可与抗体上的 生物素结合， 成为一个多级放大体系，网络了大量酶 分子，使检测敏 感性明显提高。Date11Date12亲和技术和放大技术 2、生物素与亲合素标记技术n 方法评价 （1）3种方法以BAB法较逊色，SA用量高510倍，且 灵敏度较低，故而少用。 （2）BA法和ABC法灵敏度相似，但SA-HRP制备较 ABC简便。ABC法不如BA法稳定可靠。所以3种方法 以BA法最好，应用较多。 （3）如用生物素标记一抗或二抗，可分为直接发法和 间接法；在实验类型中，也有夹心法、竞争法、竞争 抑制法和反向捕捉法等。Date13亲和技术和放大技术3、葡萄球菌A蛋白 4、凝集素 Date14谢谢！Date15
