第四章酶工程与食品产业

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1、第四章 酶工程与食品产业Contents1、酶工程概述2、酶的生产与分离纯化3、化学修饰酶与化学人工酶4、固定化酶GoGoGoGoGo5、酶反应器与酶传感器Go6、食品酶工程的应用1、酶工程概述l1.1 酶工程的发展过程l1.2 酶工程的内容1.1 酶工程的发展过程l酶工程又称酶技术，它是指酶的大批量生产与应用技术的工程。l1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得南峰淀粉酶，开创了有 目的地进行酶的生产和应用的先例。l1911年美国的华勒斯坦制得木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中的蛋白质浑 浊。此后，酶的生产和应用逐步发展。l1949年，用液体深层培养法进行细菌M-淀粉酶的发酵生产，揭开了近 代酶

2、工业的序幕。l1960年，法国的雅各和莫诺德提出操纵子学说，通过酶的诱导和解除 阻退，可以显著地提高酶的产量。l1953年，德国的格鲁布霍费和施来斯首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化 ，然后将-淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核搪核酸酶等与载体结合， 制成固定化酶。l1969年，日本的干畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL- 氨基酸生产L-氨基酸。学者们开始用“酶工程”这个新名词来代表有 效地利用酶的科学技术领域。1.2 酶工程的内容l根据研究和解决问题的手段不同，酶工程可分为 化学酶工程和生物酶工程。1.2.1化学酶工程l也可称为初级酶工程，是指天然酶、化学修饰酶、固定化 酶及化学人工酶（模拟酶

3、）的研究与应用。(1)天然酶:工业用酶制剂(2)化学修饰酶:化学修饰的途径可通过对酶分子表面进行 修饰，也可对酶分子的内部修饰，以改善酶的性能。(3)固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之 成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。(4)人工模拟酶：在深入了解酶的结构和功能及催化作用 机理的基础上，用化学方法合成的催化剂。1.2.2 生物酶工程l生物酶工程是酶学和以DNA重组技术为主的现代 分子生物学技术相结合的产物，因而也可称为高 级酶工程。生物酶工程示意图Contents of chapter 11、酶工程概述2、酶的生产与分离纯化3、化学修饰酶与化学人工酶4、固定化酶GoGo

4、GoGoGo5、酶反应器与酶传感器Go6、食品酶工程的应用2、酶的生产与分离纯化l2.1 酶生产菌的要求l2.2 发酵方法与发酵条件l2.3 提高酶产量的方法l2.4 酶的分离纯化2.1酶生产菌的要求l作为酶制剂的生产菌必须考虑以下要求：1.安全可靠；2.不易退化，不易感染噬菌体；3.产酶量高，而且最好产生胞外酶，以利于酶产品的分 离纯化；4.能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。2.2发酵方法与发酵条件l酶的发酵生产根据细胞培养方式的不同，可分为固体培养 发酵、液体培养发酵、固定化细胞等。1.固体发酵法：优点是设备简单，操作方便。缺点是缺 点是劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长。2.

5、液体发酵法：液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要 方式。3.固定化细胞发酵：由于固定化细胞发酵的历史不长， 技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器，只适用于 胞外酶的生产。2.3 提高酶产量的方法l2.3.1 酶生物合成的机制l2.3.2 打破酶合成调节机制限制的方法2.3.1 酶生物合成的机制l酶基因的表达受到严格的调节控制，酶的合成调节可在几种水 平上进行调控，即转录、翻译和复制。其中酶的合成速度主要 取决于转录速度。l原核细胞：操纵子模型所谓操纵子是指原核生物DNA上基因的一种组织形式，包括 功能上相关的几个蛋白基因和一个共同的调控区域。它们是调 节基因（R）、启动基因（P）、操纵基因（

6、O）和结构基因（S ）。启动基因决定酶的合成能否开始，启动基因由两个位点组 成，一个是RNA聚合酶（DDRP）的结合位点，另一个是环腺 苷酸（cAMP)与环腺苷酸接受蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在cAMP-CRP复合物结合到启动基因的 位点上时，RNA聚合酶才能给合到其在启动基因的位点上，这 样，酶的合成才有可能开始。l基因对酶生物合成的调节控制有三种模式，即分 解代谢物阻遏作用、酶合成的诱导作用以及酶合 成的反馈阻遏作用。l(1)分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶(主要是参与分解代谢 的酶类)的合成，这又称为葡萄糖效应。cAMP是CRP的活 化因子

7、。当葡萄糖供应充分时，cAMP浓度下降，从而导 致cAMP-CRP复合物浓度而使酶的生物合成受阻。酶生物合成的诱导作用 A-无诱导物时 B-添加诱导物时(2)酶合成的诱导作用酶生物合成的反馈阻遏作用 A-无阻遏物 B-有阻遏物(3)酶生物合成的反馈阻遏作用2.3.2 打破酶合成调节机制限制的 方法l酶合成调节控制能保证细胞最经济有效地将体 内原料和能量用于合成生命活动最需要的物质 。但人们为了需要使某些酶大量合成就必须打 破这种调节机制。一般的方法有：控制条件、 遗传控制、添加产酶促进剂等。(1)通过条件控制提高酶产量 添加诱导物l添加诱导物：这种方法中只适用于诱导酶的合成。诱导物 一般是酶的

8、作用底物，或底物类似物。还应当注意选择适 宜的浓度。当浓度超过诱导作用范围时，反而具有阻遏作 用。l降低阻遏物浓度：对于参加合成代谢的酶，可往培养基中 添加终产物形成的抑制剂，或采用营养缺陷型菌株，使共 阻遏物不能形成。对于受分解代谢物阻遏的酶，可采用直 接限制速效碳源的供应的方法。(2)通过遗传控制l根据酶合成的调节机制，要使酶产量提高，可 通过下面两条途径：一是使诱导型变成组成型 ；二是使阻遏型变成去阻遏型。可通过化学或 物理的诱导方法选育突变株。如紫外线、X-射 线；诱变剂，如亚硝酸等。(3)添加产酶促进剂l添加表面活性剂：许多表面活性剂能提高酶的 产量，特别是霉菌胞外酶的生产。可能的机

9、理 是表面活性剂提高了细胞膜的透性，有助于打 破细胞内酶合成的“反馈平衡”。l其他产酶促进剂：如枯青霉培养基中添加植酸 钙镁，可使5-P-二酯酶产量提高10-20倍。2.4 酶的分离纯化l酶的提取和分离纯化是指把酶从组织、细胞内或细胞外液 中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。l采用何种提取制备方法，决定性的因素是产品的质量要求 和制各方法的经济性。在符合质量的前提下，还应符合步 骤简短、收率高、成本低的要求。l酶的分离提纯包括三个基本环节：抽提，即把酶从原材料 转入溶剂中来制成酶溶液；纯化，即把杂质从酶溶液中除 掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂，即将酶制成各种剂 型。l根据酶本身的特征

10、，在分离纯化过程中还必须 要注意防止酶变性失活。除少数情况下，所有 操作必须在低温下进行；大多数酶在pH10条件下不稳定，故不能过酸过碱；动作 要尽量轻柔，防止泡沫的形成；由于重金属能 引起酶失活、有机溶液能使酶变性、微生物污 染和蛋白酶能使酶分解，故必须予以防止。Contents of chapter 11、酶工程概述2、酶的生产与分离纯化3、化学修饰酶与化学人工酶4、固定化酶GoGoGoGoGo5、酶反应器与酶传感器Go6、食品酶工程的应用3.化学修饰酶与化学人工酶l3.1 酶的化学修饰l3.2 模拟酶3.1 酶的化学修饰l酶的化学修饰就是利用化学手段将某些化学物 质或基团结合到酶分子上，

11、或将酶分子的某部 分删除或置换，改变酶的理化性质，最终达到 改变酶的催化性质的目的，创造出一些天然酶 所不具有的优良性能，提高其生物活性，增强 在不良环境下的稳定性，降低生物的抗原性。l酶分子化学修饰方法种类繁多，根据修饰方法 和部位的不同，酶分子的这种体外改造又可分 酶的表面修饰和酶的内部修饰。(1) 酶的表面修饰l(i) 酶的小分子修饰用小分子共价修饰酶可使酶稳定性提高。主要 是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰酶表面的 一些基团：-COO-、-NH3+、-SH、-OH等。l(ii)酶的大分子修饰根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式可分为大分子的 非共价修饰和大分子的共价修饰两类。l(a)

12、大分子的非共价修饰一些大分子可与酶非共价地相互作用（包括静电作用力、疏 水性作用力、电荷转移作用力、氢键作用力等），从而能有效 地保护酶。如抗体所起到的稳定酶的作用，其原理是蛋白质间 相互作用时，从其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数 ，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。l(b)大分子共价修饰一些可溶性大分子可通过共价键连接于酶分子的表面，形成 一层覆盖层，从而起到保护酶的效果。l(iii)分子内交联增加酶分子表面交联键的数目是稳定酶的方法之一。如胰 凝乳蛋白酶上羧基经二亚胺活化后，可与一系列二胺作用。 结果发现，用1，4-二氨基丁烷交联该酶可得到稳定性有所改 善的酶制剂。l(iv

13、)分子间交联用双功能或多功能试剂使不同的酶关联起来产生杂化酶。 如将大小、电荷和生理功能不同的二种药用酶交联在一起， 则有可能在体内将它们输送到同一部位而提高药效。l(v)反相胶团微囊化把表面活性剂溶解在非极性的有机溶剂中就可自发形成 球形反相胶团。该反相胶团的结构是表面活性剂的疏水尾 部朝外，极性头部朝内的微胶团。其内部可容纳一定量的 水。把酶液、表面活性剂和非极性有机溶剂，经简单的振 荡就会自发形成反相胶团，酶分配在反相胶团内部的水性 环境中，从而把酶和胶团外部有机溶剂分开，避免了酶变 性。(2) 酶的内部修饰l(i)非催化活性基团的修饰通过修饰酶的非催化残基，可改变酶的动力学性质，改变酶

14、 对特殊稀薄物的束缚能力。l(ii)酶蛋白主链修饰天然酶并非都处于最佳的催化构象状态，将酶分子的某部分 删除有可能增强酶活力。至今，酶蛋白主链的修饰主要是靠酶 法。l(iii)催化活性基团的修饰利用化学手段将酶分子上的某部分删除置换，也有可能改变 酶的催化性质。(3) 与辅因子相关的修饰l(i)依赖辅因子的酶的修饰对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：第一种方法，如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅 因子共价结合于酶分子上。第二种方法，引入新的具有强反应的辅因子。金属酶ALBP-Phen-Cu(II)的合成l(ii)金属酶的金属取代有些酶含有金属离子。而且金属离子往往是 酶活性中心的组成部分，

15、对酶的催化功能起重 要作用。酶分子中的金属取代可以改变某些酶 的专一性、稳定性及抑制作用。(4)肽链伸展后的修饰l有科学家描述了一种新奇的、原则上可能普遍适 应改变底物专一性的方法，即为有效地修饰酶分 子内部的区域，先用脲、盐酸胍处理酶，使其肽 链充分伸展，然后让修饰后伸展肽链，在适当条 件下，例如，加入相应于所希望酶活力的竞争性 抑制剂，然后待获得所希望酶的构象后折叠成具 有某种催化活性的构象，再用戊二醛交联，以固 定这个构象，然后透析除掉这种抑制剂。但至今 尚未有成功的先例。3.2模拟酶l模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状 、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用 机理和立体化学等特

16、性的一门科学。l模拟酶的制备有两类方法：半合成酶和全合成 酶。3.2.1半合成酶l它是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进 适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种 新的“人工酶”。(1)与金属或金属有机物的结合将具有催化活性的金属或金属有机物与特异的蛋白质结 合可形成半合成酶。例如，电子传递催化剂Rn(BH3)53+与 巨头鲸肌红蛋白结合产生的一种“半合成无机生物酶”。(2)与特异性的物质结合有的半合成酶是与具有特异性的物质相结合而形成的。3.2.2 全合成酶l这类模拟酶不是蛋白质，而是有机物，通过加 入酶的催化基团与控制空间的构象，象自然酶 那样能选择性地催化化学反应，包括小分子有 机物、抗体酶和印迹酶。(1)小分子有机物全合成酶这是利用各种有机分子和金属离子成功地水 解、氧化还原等合成酶。这类合成酶由于不是 蛋白质分子，故比天然酶具有更好的稳定性， 在化工、日化、食品、医药的应用上具有较大 的优越性。(2)抗体酶l抗体的精细识别性使其能结合几乎任何天然的或合成的分 子，利用兔疫系统的这一特性将抗体开发成适合特定用途 的酶，是很有意义的研究。l催化抗体是