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1、生物技术与应用重组DNA技术与基因工程华东理工大学 张惠展重组DNA技术与基因工程5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化A 重组DNA技术的基本定义1 重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体
2、外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。B 基因工程的基本定义1 重组DNA技术与基因工程的基本概念基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。C 重组DNA技术与基因工程的基本用途1 重组DNA技术与基因工程的基本概念分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种D 基因工程的基本形式1 重组DNA技术与基因工程的基本
3、概念第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程D 基因工程的基本形式1 重组DNA技术与基因工程的基本概念C 重组DNA技术与基因工程的基本用途B 基因工程的基本定义A 重组DNA技术的基本定义A 重组DNA技术的理论基础2 重组DNA技术与基因工程的基本原理19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA1973年 伯格-杰克森-考
4、恩-鲍耶 DNA分子体外拼接分子遗传学1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 基因工程B 基因的分子生物学2 重组DNA技术与基因工程的基本原理C 基因工程的基本原理2 重组DNA技术与基因工程的基本原理提高外源基因的剂量分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、 增强子、操作子、终止子、上游调控序列等列、mRNA非编码区、密码子等分子生物学原理 修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序 基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产生化工程学原理 分子生物学原理 D 基因工程的支撑技术2 重组DNA技术与基因工程的基本原理核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交
5、技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术A 用于核酸操作的工具酶3 重组DNA技术所需的基本条件限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III 限制性核酸内切酶限制
6、性核酸内切酶的类型主要特性 I 型 II 型 III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAMATP Mg2+ SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名H i n d III H i n d IIIHaemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内
7、切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-
8、T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPPstI等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHPPvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-
9、G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶 Volume20 - 100 ml T T37 1 - 1.5 hr1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小
10、时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C
11、-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknickDNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5DNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3
12、3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mM Volume10 - 20 ml T T4 - 15 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量DNA连接酶平头双链DNA片段的连接操作从分子
13、动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mMDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）53的DNA聚合酶活性53的核酸外切酶活性35的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-
14、G-T-OH5 ppp dN Mg2+3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNA pol IDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowd
