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1、生物学实验室仪器的应用与实验技术The applications and techniques of experimental equipments in biology张学琴生命科学大楼4027室 Tel: 62732654, 62734837 Email: zhangxq711-讲课讲课 老师师内容时间时间讲课讲课 地点实验实验 地点张学琴离心机9月12，14日生命科学大 楼B080生命科学大楼 4015 张学琴张学琴光谱9月19，21日生命科学大 楼B080生命科学大楼 4051 张学琴凌毅芯片9月26，28日生命科学大 楼B080生命科学大楼 2060 闫红刘毅敏Confocal10月
2、10，12日生命科学大 楼B080生命科学大楼 4012 刘毅敏张远 涛(张学 琴)定量PCR仪10月17，19日生命科学大 楼B080生命科学大楼 4051 张远 涛陈艳 梅蛋白质组 学 (含双向电泳 和数据分析)10月24，26日生命科学大 楼B080生命科学大楼 2069 陈艳 梅李 溱液质联仪10月31日，11 月2日生命科学大 楼B080生命科学大楼 2069李溱张学琴考试11月16生命科学大 楼B080本课程主要介绍生物学实验所用的常用仪器及 其在生物研究中的应用。主要包括：离心技术（超速和高速）；光谱技术（紫外、原子、荧光）；基因芯片技术显微技术（Confocal，etc)；定量
3、PCR技术蛋白质组学液质联仪参考书：1、周先碗 胡晓倩 编 生物化学仪器分析与实验技术化学工业出版社（第三版） 2、王立 汪正范 牟世芬 丁晓静 编著色谱分析样品处理 化学工业出版社 3、师治贤 王俊德 编著 生物大分子的液相色谱分离和制备 科学出版社（第二版） 4、 5、结课方式：考试（50%）课程论文（50%）一、离心技术一、离心技术 二、离心机的种类二、离心机的种类 三、离心机和转头的维护三、离心机和转头的维护 四、离心机的事故四、离心机的事故 五、离心技术在样品制备中的作用五、离心技术在样品制备中的作用第一章 离心技术1.离心机发展历史 2.基本概念 3. 离心分离方法一、离心技术一、
4、离心技术19世纪 手摇离心机 蜂蜜、牛奶 20世纪 超速离心机 生物学、医 学、制药工业等广泛应用。1. 离心机发展历史1923年 瑞典化学家 Svedberg 第一台具有光学系统的分析超速离心机，最高转速达45,000rpm。1926年 Svedberg 测定马血红蛋白分子量，首次证明蛋白质为均一的生物大分子。1940年 Svedberg和同事Pederson撰写世界上第一本有关离心技术的专著。超速离心技术发展阶段1951年 Brakke M K 在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。1955年 Anderson N G发明了区带转头，并用区带离心法首次证明DNA双螺旋结构半保留复制的假说
5、。离心机制造工艺；区带转头；高强度 的钛合金的应用；半导体集成电路；计算 机技术的发展；高频调速电机的使用。20世纪90年代中期碳素转头（超强超轻材料合成）， 抗拉强度比钛合金强。1、基本概念(1)、离心技术（Centrifuge Technique）:利用物质在离心力作用下，按其沉降系 数不同而分离的一种技术。(2)、沉降现象 任何物体受地球引力的作用都具有下沉 的现象，称为沉降现象。 =gt(g为重力加速度，980cm/s2)。物体在沉降过程中，其下沉的力在某个时刻 总会与摩擦力、浮力达到平衡，使物体的受力 为零，此时物体在做匀速运动，此时的速度称为 临界速度。 一个球型颗粒在具有重力场中
6、的液体介质内 ，受到地球引力、溶液浮力和溶液黏滞力的作用 ，出现不同的运动（粘滞力和浮力向上，重力向 下）。重力 Fg1/6d3pg(d为颗粒直径，为颗粒密度，g为重力加速度)。（3）颗粒在重力场的运动粘滞力Ff=-3dV (V为颗粒沉降速度)浮力Fb=-1/6 d3m g (m为介质密度)当作用在颗粒上的总力为零时，颗粒做匀速运动，即达到临界速度，作用力的关系式为：Fg = Fb+Ff；Vd2(p-m)g/18（a）、与颗粒直径d2的大小成正比，颗粒大沉降快。 （b）、与颗粒和介质密度差(p-m)成正比，密度之差越大，沉降越快。 （c）、当pm，颗粒沉降速度为正值，即颗粒在介质中往下沉；等于
7、，做不定向运动 ；小于，颗粒在介质中上浮。 Vd2(p-m)g/18（d）、与引力g成正比，速度随着引力的增加而增加。（e）、与介质粘度成反比，速度随粘度的增加而降低（4）颗粒在离心场中的沉降5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力 从理论上讲，只要颗粒的比重大于液体就会发生沉降，但是对于分离生物材料 的样品，如细胞、细胞器、细菌、病毒、 蛋白质和核酸等生物大分子来说，由于颗 粒非常细小，依靠自然沉降是不能达到完 全分离的，只能通过离心力的作用才能使 它们沉降下来。 离心力的产生离心场的受力：G2r 物体在围绕转轴以角速度旋转时，就产生 离心场，物体在离心场中受到离心力的作用。电机的速度
8、以每分钟的转数（r/min）表示。G2r42N2r/3600(N为每分钟的转数，单位为r/min；G 的单位是cm/s2，正好与重力加速度g的单位 一致。)在实践中，离心力可用重力加速度的倍数 G/g来表示，称之为相对离心力，用RCF表示， 可将公式写成：RCFG/g=(42N2r/3600)/980=1.1210- 5N2rN=1000(RCF/11.2r)1/2相对离心力（RCF）因此，超速离心常用重力加速度的倍数（g ）来代替转速（r/min），真正反映颗粒在离 心管中所受到的离心力。一般，低速离心，转速以r/min表示； 高速离心，转速以重力加速度g表示。计算颗粒相对离心力时，应注意离
9、心管 与中心轴间的距离，即离心半径r的长度。离 心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离 心力也不同。沉降系数（sedimentation coefficient, S）S= /2r=(p-m)d2 8沉降系数是生物大分子的特征常数，与颗粒密度、 形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都 有关系。20，以水为介质的条件下，测得S值为 标准状态下的S值。1S=10-13秒 K因子(表示沉降系数为s的颗粒，在转头的最大速 度下离心时，颗粒从小半径沉降到大半径所需要的 时间。)t=K/s 表示从离心管表面沉降到离心管底所需要的时间。 K是转头的实际参数 沉降与相关因素离心速度 其大小决定颗粒沉降的
10、快慢，不 同大小的颗粒使用不同的离心速度。大颗粒 ，质量大，在离心场中沉降速度快，只需低 速离心。反之，需高速离心。温度 不同温度下，不同介质的粘度不同。 多数离心介质的粘度都会随着温度的变化 而变化。因此在离心时要求温度恒定，尤其 梯度离心对温度比较敏感，对离心环境温度 要求较严。 离心时间离心半径设定半径的目的：一是有一定的离心体积；二是根据转头大小半径决定颗粒下 沉的距离。尤其在梯度离心时，距离 短是不易将物质分开的。 t=(1013/3600)(lnrb-lnrm)/2s rb：轴与离心管间距离 Rm：轴与管液面间距离3. 离心分离方法沉淀离心 差速离心 速率区带离心 等密度离心 淘洗
11、离心 连续流离心（1）、沉淀离心常用方法。指介质密度约1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮液中的悬浮颗粒在离心的作 用下完全沉淀下来，这种离心方式称沉淀离心 。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。颗粒沉降离心中的两个因素：相对离心力（g）和时间（min）沉降某颗粒需10,000g* min10,000g离心1min100g100min1000g10min2000g5min凡是利用颗粒在离心 场中的沉降系数差异进 行逐级分离的离心方法 ，称差速离心。差速离心是建立在颗 粒的大小、密度和形状 有明显的不同，沉降存 在较大的差异的基础上 进行分离的方法。一般 用于粗级分离，而不用 于精细分离。（2）、差
12、速分级离心（3）、密度梯度离心凡使用密度梯度介质离心的方法称这密度梯 度离心或称区带离心。分辨率比差速离心高： 差速离心 沉降系数相差10倍以上； 密度梯度离心 沉降系数相差10%20%s的颗粒 或颗粒或密度差小于0.01g/ml的组分。注意两点：一是制备梯度液时，应考虑样品体系中最小颗 粒的密度大于任何位置的介质密度。二是控制离心时间，要在所需样品到达管底前 停止离心。 两种类型：速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层。可分离与密度介质相当 的细胞、细胞器、DNA和 蛋白质，分离效果只与分 离物质的的大小有关，与 介质的密度无关。等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。在等密度介质中的 密
13、度范围正好包括所有 分离颗粒的密度。样品 可以加在制成的梯度介 质的上面，也可以与密 度介质混合在一起，离 心后会形成自成型梯度 。颗粒在等密度梯度的介质中，经过离心， 最终将停留在与其浮力密度相等的区域内 ，形成一个区带。颗粒密度和介质密度达到平衡时，所形成 的颗粒区带就停止运动，延长离心时间对离 心效果无明显影响，即此时与离心时间无 关。密度梯度离心的制备：密度梯度溶液不均一，密度随着旋转半径的增加而增加e.g. 5%（1.018g/ml）20%(1.077g/ml)蔗糖为梯度液密度梯度材料氯化锂，氯化铯，氯化铷，酒石酸钾，甘油， 蔗糖和聚蔗糖等。梯度材料的选择不能与样品发生化学反应 pH
14、、渗透压 不能影响所用的测量技术，e.g. 蛋白质280nm 不能对转头有腐蚀梯度的形状预成型梯度：线性梯度，不连续的阶梯梯度，指数梯度自成型梯度蛋白质 酶 核核糖体亚基 植物病毒细胞 动植物组织 中的亚细胞易上浮 的脂蛋白梯度的制备不连续梯度通过手工制作 梯度界面不能破坏连续梯度：梯度混合器加样用注射器将样液加在梯度液上面 样品体积和浓度适量注意：离心管内的梯度液可承受的样品的最大浓度为该密度梯度液中最低密度梯度浓度的1/10。等密度加样：样液加在密度介质的上面或与密度介质混合在一起。不要污染样品 不要破坏梯度的稳定性 在操作过程中不能使气泡进入梯度中加样时注意：样品的回收手工回收二、离心机
15、的种类二、离心机的种类1.按离心机的速度：（1）、低速离心机 最大转速（Vmax）一般在6000r/min。 （2）、高速离心机 Vmax 25000 r/min （3）、超速离心机 Vmax 100000 r/min(一)、分类2.按离心机的用途：（1）、小型离心机 小量快速离心（2）、制备型大容量低速离心机 Vmax 6000 r/min，最大离心力6000g，最大容量达500ml6。（3）、高速冷冻离心机 Vmax1800021000 r/min，最大离心力在50000g。适用于细胞和亚细胞 的分离。（4）、超速离心机 最大离心力可达800000g， 可进行小量制备，适用于蛋白质、核酸和
16、多糖等生 物大分子的制备。（5）、分析型离心机 用于生物大分子定性、定 量分析。（6）、连续流离心机 处理类似于发酵液等特大 体积、浓度较稀的样品，最大离心速度与高速离心 机相似。3.按离心机的驱动系统：（1）、空气驱动离心机 （2）、油涡轮驱动离心机 （3）、电刷电机驱动离心机 （4）、变频电机驱动离心机（二）、基本结构真空系统离心室制冷系统驱动系统光学系统控制系统转头（1）、分类角转头 适用于差速离心、等密度离心，容 量大，转头内容纳的离心管多。水平转头 离心管组装在转头的吊桶内，离 心机静止状态时离心管为垂直状态，离心时离心管 与轴垂直。适合于区带离心和等密度离心。垂直转头 适合于质粒DNA的纯化，不适合 于差速离心。近垂直转头 对质粒DNA和RNA的分离纯化 特别有效。区带转头 连续流转头 1. 转头分离速度（时间，转头半径）垂直转头 近垂
