[2017年整理]产枯草芽孢杆菌实训报告

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1、生化工艺实训报告 一 产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的优 化 1、产淀粉酶枯草芽孢杆菌斜面活化 2、摇瓶发酵优化培养基及种子培养 3、葡萄糖标准曲线的制备 4、发酵参数的测定1、产淀粉酶芽孢杆菌斜面活化 实验材料 菌种：从土壤中分离产淀粉酶的枯草芽孢 杆菌 配方：牛肉膏蛋白胨培养基 蒸馏水400ml、牛肉膏2g、蛋白胨4g、氯 化钠2g、琼脂0.2g、PH7.07.2 试剂：牛肉膏、氯化钠、氢氧化钠溶液、 蛋白胨、琼脂、盐酸溶液实验内容 1、制备培养基：依照培养基组成稀释后定容400ml，分 装与6个摇瓶中，50ml。剩余溶液分装与6个试管中，均 10ml，并加0.2g琼脂。 2、灭菌：高压灭菌锅 1

2、21摄氏度 0.11MPa 2030min 3、斜面摆放：灭菌后的试管静止冷却至50摄氏度左右 ，将试管的液面及搁置的试管斜面长度不超过试管总长 一半，凝固后待用。 4、斜面活化：在超净工作台中将保藏的芽孢杆菌接种 置已制好的斜面上划线。 5、恒温培养：恒温培养箱 37摄氏度 过夜培养进行活化2、摇瓶发酵优化培养基 实验材料 试剂：牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 淀粉 葡萄糖 仪器设备：分光光度仪、超净工作台、烧 杯、摇瓶、电炉、斜面活化的菌种、牛肉 膏蛋白胨液体培养基、玻璃棒等玻璃仪器 实验步骤：恒温水浴锅分光光度计1、摇瓶发酵培养基优化 发酵优化方案葡萄糖 g淀粉 g蛋白 胨 g牛肉膏 g氯化 钠

3、溶 液 ml蒸馏水 mlPH值接种量 %摇瓶 装量方案1220.050.51007.07. 2250方案2210.050.51007.07. 2250方案3111.50.050.51007.07. 2250方案41.50.51.50.050.51007.07. 2250方案521.50.050.51007.07. 2250方案621.50.050.51007.07. 2450摇瓶发酵培养基优化 实验步骤 依照优化培养基配方制备相应试剂，每个 配方平行试验两次 灭菌：将12个摇瓶与高压蒸汽灭菌锅内进 行灭菌 121摄氏度 0.11MPa 1520min种子培养 接种：选取生长状况良好的试管斜面进

4、行 接种，挑取活化菌接种到液体培养基中， 平行6个 培养条件：37摄氏度 摇床培养 注意事项： 确保在灭菌环境中进行 对培养基进行标注，以免混淆3、葡萄糖标准曲线的制备 试验步骤 1）DNS试剂的制备：称取3.25gDNS溶与热蒸馏水中， 加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml，再加入22.5ml丙三 醇，摇匀，冷却后定容500ml，待用。 2）葡萄糖标准试剂待用中 3）在下述试管中分别加入DNS 试剂2ml于沸水浴中加 热2min进行显色，取出后立即冷却，各加入蒸馏水 9.0ml，摇匀，在分光光度计中540nm波长处测定光吸收 值。 4）以葡萄糖含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制 标准

5、曲线管号葡萄糖标 准液蒸馏水葡萄糖浓 度OD540001.00010.20.80.40.02020.40.60.80.05030.60.41.20.06440.80.21.60.09051.002.00.127葡萄糖标准溶液葡萄糖标准曲线3、发酵参数的测定 实验步骤 在超净工作台上将方案1、2、3、4、5均 按2%接种量进行接种，在180r/min的摇床 进行培养；方案6接种4%在120r/min的摇 床上进行培养。每隔一小时进行取样（包 含0小时），检测酶活、菌浓、及其PH值 。 根据各数据挑选最优培养方案。生长曲线绘制 将取样稀释后与分光光度计（波长600nm ）测OD值，空白为蒸馏水。

6、绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐 标为菌浓。生长曲线参数数据时间波长蛋白胨 2g 方案1蛋白胨 1g 方案2淀粉 1g 方案3淀粉 0.5g 方案4接种量 2% 方案5接种量 4% 方案60时600nm 处OD 值0.1540.090.1760.1920.0770.221时0.2220.170.2340.2280.1680.2462时0.2680.220.2460.4510.2460.3643时0.3080.2280.340.5520.260.3854时0.3360.2640.5850.5920.2920.396生长曲线酶活测定 发酵液离心处理 8000rpm 5min 1ml离心后的上悬

7、液加入5ml1%淀粉溶液与37摄 氏度水浴5min，然后沸水浴5min，终止反应。 取上述溶液1ml加入DNS试剂2ml与沸水浴加热 ，2min进行显色反应，取出后迅速冷却，各加 入9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测光吸收 值。以发酵液加1%淀粉溶液直接加热，煮沸后 再加2mlDNS试剂，作为空白。酶活测定参数数据时间蛋白胨 2g 方案1蛋白胨 1g 方案2淀粉 1g 方案3淀粉 0.5g 方案4接种量 2% 方案5接种量 4% 方案60时13.0588.1265.3229.66211.85113.511时14.59111.1538.7688.68025.59614.1132时23.37

8、212.2213.96418.06431.521.3823时8.85811.2106.77712.82116.91012.934时17.09114.1067.59111.93419.26313.02酶活曲线实验总结分析 根据生长曲线图及酶活曲线，可得方案5 的培养基为最优培养基。 根据本组试验结果分析淀粉量的增加未使 菌体的生长量及酶活有一定量的增加，分 析有可能是试验过程中操作不当，或染菌 。二 青霉素发酵生产仿真操作 操作步骤 空罐灭菌 实罐灭菌 正常发酵 重要参数： 补糖 初始参数20 硫氨 初始参数12 前体15 氨 水10 消泡剂 初始80 排气37 空气进气55二二 枯草芽孢杆菌实

9、罐操作枯草芽孢杆菌实罐操作青霉素仿真总结及分析 仿真操作加强了同学们的动手能力及对实 操的认识及掌握。 在不断的练习中，逐步熟练并对参数数据 有了更加清楚的掌握和控制。 对同学们的实操奠定了基础。枯草芽孢杆 菌发酵的实 罐操作二 枯草芽孢杆菌的实罐操作实验材料及仪器设备 10L-100L 二级发酵罐及其附属设备 分光 光度计 旋转式摇床 离心机 水浴锅 恒温 培养箱 超净工作台 全自动灭菌锅 摇瓶 移 液管 玻璃棒 烧杯 等玻璃仪器 试剂 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 氢氧化钠 DNS试剂 1%淀粉 实训意义 生化工艺实训是为了让学生掌握一定的生 物化工工艺单元操作基本技能的基础上进 行的一

10、次综合性实践训练。主要对有机品 发酵过程中常见的单元操作过程及设备进 行的基本操作技能训练。防止染菌的要点 染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就 不能实现优质高产。影响染菌的因素很多 ，而且带随机性质，但只要认真对待，过 细地工作，染菌是可以防止的。请到左边 的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内 容。空气系统的要求 防止空气带菌主要是提高空压机进口空气 的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过 滤器失效。 提高空压机进口空气的洁净度，可以从提 高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤 着手。防止空气夹带油、水，除加强去除 油、水的措施外，还必须防止空气冷却器 漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力 ，防

11、止冷却水进入空气系统。蒸汽系统的要求 重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带 大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动， 保证生产时所用的蒸汽压力在3035千帕 以上。 1、连续灭菌设备：连消塔结构要求简单， 易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混 合均匀，并易于控制温度。 2、发酵罐：发酵罐及其附属设备应注意严 密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡与物料 、空气、下水道连接的阀门都必须保证严 密度。 3、无菌室：用超净工作台及净化室代替无 菌室，以提高无菌程度。一、种子的制备 种子的制备 培养基 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml PH 7.07.2 将配置好的培养基放

12、入250ml的三角瓶中 装液量为100ml，数量11个 。装液后进行 高温灭菌。 一级种子的制备 选取长势良好的菌种，挑取菌落23环 接种导液体摇瓶中。 培养条件：180r/min，37摄氏度摇床过夜 培养。 二级种子液的制备 将初级种子液接种到药瓶培养基中接种 量为2ml。 培养条件：180r/min，37摄氏度摇床过夜 培养。二、发酵液配置 发酵培养基配方：牛肉膏1%、 蛋白胨8% 、蔗糖3%、淀粉1.5%、氯化钠0.5%、蒸 馏水 86%、硫酸铵0.4% 无水氯化钙0.2% 。 将发酵培养基按照上述配方比例配好共配 培养基45L，因为在蒸汽灭菌过程中会产 生大量的冷凝水，导致发酵培养基被

13、稀释 ，所以初始加入的培养基为45L,这样可以 避免培养基的稀释。三、空罐灭菌 空气过滤器灭菌，灭菌后对空气过滤器通空气进 行保压，使压强保持在0.10.15mpa之间防止染 菌。 对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐 体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强 0.11mpa时，保持温度和压力20min。 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，进行泄 压。四、实罐灭菌 泄压后，从进料口开始添加培养基，并开始搅拌（转速 130r/min） 进料完毕后开始调节PH值 调好PH后，对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐体

14、经行 升温，当温度达到120摄氏度、压强0.11mpa时，保持 温度和压力20min。 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，当压强下降到 0.08mpa时开启通气阀。使罐内压力保持在0.05mpa左 右。 开启冷水阀门，对发酵罐进行降温。五、接种 当罐温降到37摄氏度后，关闭冷水。用酒精将 接种口处仔细擦洗，并放上接种火圈。 减少进气，使罐压保持在0.02MPa，点燃接种火 圈。 拧下进料口螺盖，放入酒精中,以免染菌。 按接种瓶的瓶口在火焰上灼烧一下，并在火焰的 保护下，迅速将菌种倒入发酵罐。 盖上进料口螺盖，熄灭火焰。并用酒精仔细清洗 。接种 在无菌环 境下进行六、发酵 发酵条件：37摄氏度

15、、压强0.07kpa、搅 拌转速200r/min 取样：取样前用热蒸汽将出料口处进行灭 菌10min。 发酵参数的测定 1、PH值的测定：用精确的PH试纸测。2、生长曲线：分光光度计波长600nm测od值（以相同稀释倍数的培 养基做空白）。以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线 图。 3、淀粉酶活力的测定： 1)样品液的制备： 发酵液离心处理：8000rpm，5min 1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液与37摄氏度水浴反应，然后沸水 浴5min终止反应。取上述溶液1ml，加入DNS试剂2.0ml于沸水浴中加热2min进行显色， 取出后用水迅速冷却 ，加去9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定 吸光值。 2）空白液的处理： 发酵液离心处理：8000rpm，5min 1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液直接加热煮沸5min，取1ml，加 入DNS试剂2.0ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却 ，加去9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。七、发酵过程中参数检测结果时间时间酶活生长长 量PH值值10.292 50.2867.220.971 150.2667.032.171 51.257.246