化学分析方法验证

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1、化学分析方法验证化学分许方法验证成功的前提l能够研究建立一个有水准的分析方法的能力 l有化学分析方法验证的知识和水平化学分许方法验证成功的前提l有水平，经过培训的实施人员l仪器性能已经得到确认（校准，验证，校准在 有效期内）l可靠的对照品（法定机构提供的或有水平自己 建立的）l质量可靠的实验试剂存在问题主要表现在：l方法设计不科学l方法没有充分的研究，优化l验证的目的性不明确，验证不充分l实验过程不规范，验证通不过的处理方法错误l验证数据不合理l忽视方法在验证什么时候分析方法需验证符合下列情形之一的，应对检验方法进行验证： 1.建立或采用新的检验方法2.分析对象或检验方法变更了3.采用中国药典

2、未收载的检验方法4.法规规定的其他需要验证的检验方法什么时候分析方法需验证（续）l对不需要进行验证的的检验方法，应进行方法 确认，以保证检验数据准确可靠。l2005版药典中分析方法验证指导原则（附录 XIX A）只规定了项目和基本方法而没有合格 标准，ICH和USP类似。方法学验证对分析方法的科学性，准确性和可行性进行验证，充分表明分析方法符合测试项目的目的和求 。方法验证的目的目的是判断采用的分析方法是否科学，合理，是否有效控制产品的内在质量。需要验证的检测项目1.鉴别目的在与判定被分析物是目标化合物而非 其他物质。共存，相似的化合物要分开。要考察其他 成分和辅料的干扰，空白试验一定要成阴性

3、。需要验证的检测项目2.杂质检查主要用于控制住成分以外的杂质，如有机杂 质，无机杂质。限度检查定量检查需要验证的检测项目l限度检查各种无机离子检查等l定量检查定量测定： 干燥失重，水分，有关物质，残留溶剂及其他特定检测项目等。 需要验证的检测项目3.含量测定 除主成分外，也包括检查项下的防腐剂，溶出度等的含量测定等。验证内容l准确度l精密度（重复性，中检精密度和重现性）l专属性l检测线（LOD）l定量限（LOQ）l线性l范围l耐用性准确度定量方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用回收 率%表示。l原料药已知纯度的对照品或供试品已知准确度的另一种方法比较l制剂配置回收试验法加样回收试验法已

4、知准确度的另一方法比较l杂质准确度对于中药a. 以经典方法的测定值作为真值，建立方法的 测定数据与之比较（该法适用于化学单体药物）b. 以加入对照品测定的回收率表示，一般有空 白回收（制剂空白）和加样回收的测定方法（中药 材，复方制剂等）准确度回收试验：测定值（M），空白，已知量A 的 对照品测定回收率：R= 100%加样回收试验：测定值（M），背景值（P），已知量的加入的对照品（或标准品）的值（ A）回收率：R= 100% （M,P为均值）M-空白AM-PA准确度试验方法：规定的范围内，至少用九次测 定结果评价，如制备高，中，低三个不同浓度 样品各测三次。 准确度试验方法（中药）同一样品，制

5、备相同浓度的6份供试品（样品 取样量减半，以1：1比例加入对照品）同一样品，制备三个浓度的供试品，每个浓度 分别制备三份供试液，对照品的加入方式有三 种方式。对照品的加入方式l取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计三个浓度 ，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1；1比例加入，低， 高浓度可选0.5：1，1.5：1的比例，加入对照品的量要适当，保 证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。l取3种不同量的样品个三份，每个取样量分别按1：1比例加入对 照品，中间浓度已选定正常浓度，其他两个浓度可以结合范围测 定项目选择低，高浓度。l按表示量计算得组分，可参订化学药品测定方法，取9份

6、样品， 按0.8：1，1：1，1：1.2的比例加入对照品（样品取样量减半）精密度精密度是指在规定条件下，同一个均 匀样品，经多次取样测定所得结果 之间的接近程度。用偏差（d），标 准偏差（SD），相对标准偏差（ RSD）（变异系数CV）表示。偏差（d）d=xi-x 测量值与平均值 之差标准偏差（SD）SD相对标准偏差（RSD）RSD=精密度l重复性：在相同条件下，有同一个分析人员测定所得 结果的精密度 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备 不同浓度样 品各测三次把被测浓度当做100%，至少测6次进行评价 l中间精密度：同一实验室，不同时间有不同的分析人 员用不同设备所得结果的精密度（

7、三人三机）l重现性：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密 度。以SD，RSD表示。 专属性专属性只有其他成分（杂质，降解物，辅 料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定 出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时 对供试液准确而专属的测定能力，是指该法用 于复杂样品分析时是否受相互干扰程度的度量 。专属性l通常是通过分析含有加了杂质，降解产物，有 关化学物质或安慰剂成分的样品，将所获的分 析结果与未加前述成分之样品的测试结果进行 比较，两组测试结果只差即为专属性。专属性l鉴别反应应能与可能共存的物质或结构相似化合物区别不含被分析的样品，以及结构相似或组分 中的有关化合物均应呈负反应专属性含量测

8、定和杂志测定l色谱法和其他方法：附带表性图谱说明专属性l表明各组分的位置，分离度是否符合要求l杂质或辅料可获得的情况下，试样中可加入杂志或辅料，考察测 试结果是否受干扰l对于杂质测定也可相试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是否 得到分离 色谱峰纯度试验（二极管阵列，其他检测器，质 谱）专属性l破坏性试验高温，高湿，光照，酸破坏，碱破坏，氧化破坏l注意观察降解产物生成情况，分离度是否符合 要求l注意掌握破坏条件，应使主成分峰保留大约 90%检测限在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度 或含量l目视法（直观评价，非仪器分析）可用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法，用已知浓度的被 测物，

9、试验出能被可靠的检测出的最低浓度或量l信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓 度试样测出的信号与空白样品的信号进行比较，算出能被可靠的检测出 的最低浓度或量，一般以信噪比3：1或2：1时的相应浓度或注入仪器的 量确定检测l标准差法定量限被测定物质能被定量测定的最低量，结果仍具 有一定准确度和精密度的要求。l目测法（直观评价，非仪器分析）用已知浓度的被测物，试验出能被可靠的检测出符合准确度 和精密度要求的最低浓度或量l信噪比法l一般以信噪比（S/N）为10：1时相应的浓度或注入仪器的量进 行确定。检测线和定量限试验时应注意A： 应以实验中得到的浓度分析，而不能靠推 算

10、。B:应以定量浓度限为依据确定对照溶液浓度（ 一般扩大2050倍）线性l线性是指再设计范围内，测试结果与试样中被 测物浓度直接呈正比例关系的程度。l线性应在分析需要的范围内进行评价l一般以最小二乘法处理数据求的回归曲线的斜 率来表示，必要时可对响应信号进行数字转换 。l数据要求：至少需要五个浓度考察线性，需提 供相关系数，Y截距，应列出回归方程数和线 性图。范围l范围是指达到一定精密度，准确度和线性条件下，测 试方法是用的高，低限量浓度或量的区间。l范围应根据分析方法的具体应用和线性，准确度，精 密度结果和要求确定。l原料药和制剂含量测定范围为80%-120%l制剂含量均匀度范围为70%-13

11、0%l杂质测定应为被测杂质限度的-20%到+20%l溶出度应为测定范围的-20%到+20%，释放度因规定 了限度范围，应为下限的-20%到上线的+20%，例如 缓释片1h70%，则验证范围定为0-90%耐用性l耐用性又称粗放度，是指测试条件稍有变动时，结果 不受影响的承受程度。失衡连试验室和工作人员之间 的正常情况下试验结果重现性的尺度，如方法易受分 析条件的影响，或要求苛刻，应注明l典型的变动包括： 1.分析溶液的稳定性用不同时间段的样品和标准品溶液与新制的标准 品溶液的对比结果来分析溶液的稳定性 2.提取方法，溶剂，次数，时间等耐用性3.液相色谱的典型变动：流动相PH（-0.5+0.5）流

12、动相组成（有机相-0.5至+0.5）色谱柱(同一厂家三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸 ）)温度（20-25摄氏度）和流速（-10%至+10%）检测波长（-5nm至+5nm） 4.气象色谱的典型变动：色谱住(同一厂家三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸 ）)温度流速耐用性l如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以 写明。检测项目和验证内容总结中国药典鉴别杂质测 定杂志限度测定含量溶出度等准确度-+-+精密度-重复性-+-+精密度中间精密度-+-+专属性+检测限-+-定量限-+-线性-+-+范围-+-+耐用性+分析方法验证注意要点l空白样空白样是指根据样品的特性，配方和

13、工艺 过程，制备除了不含被测物外其他组成与样品 完全一致的模拟样品l预验证预验证是指在正式验证前进行的试验，目 的是收集证据，已初步证实该检验方法可达到 预期要求，同时确定各个项目单位可接受标准 。含量测定方法验证的可接受标准l准确度各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率 数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。中药一般应满足以下规定：回收率计算值在95%-105%范围， 相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法5%l精密度1.重复性：6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%2.中间精密度：相对标准差应不大于2.0%含量测定方法验证的可接受标准l专属性空白对照应无干扰

14、，主成分与各有关物质 应能完全分离，分离度不得小于2.0l检测限l l定量限含量测定方法验证的可接受标准l线性回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴 截距应在100%响应值的2%以内，响应因子的 相对标准差应不大于2.0%。l耐用性 主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰的杂质峰 必须达到基线分离，各条件下的含量数据（ n=6）的相对标准差应不大于2.0%分析方法的确认方法确认是一种简化了的方法验证，目的 是为了确认药典方法或其它已经验证的方法是 否适用于实际使用的环境。l各国药典和行业法规收载的检验方法l从外部引入的已经检验的检验方法l以往老产品的检验方法，原厂无力或无法进行 方法传递。

15、方法确认一般应进行准确度，重复性，专 属性测试。分析方法传递分析方法传递（转移）是指一方将已经验 证的方法传送（转移）给另一方的过程。方法传递主要进行在不同的实验室在一定 时限内对同一份样品的重现性测试的结果比对 。系统适用性试验对一些仪器的测试方法，在进行方法验证 时，有必要将分析设备，电子仪器与实验操作 ，被测试样品等一起当做完整的系统进行评估 。系统适用性便是对整个系统进行评估的指标 。系统适用性试验参数的设置需根据被验证 方法类型而定。系统适用性试验含量测定方法可接受的标准主峰的峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主 峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另 外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂 质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应 符合质量标准的规定。方法在验证在某些情况下，如原料药合成工艺的改变，制 剂处方改变，分析方法发生改变等，均有必要 对分析方法再次进行全面或部分指标的验证， 以保证分析方法可靠，这一过程称为方法在验 证。在验证原则：根据改变的程度进行相应的 在验证。方法在验证l当合成工艺发生改变时l当制剂的处方组成改变，辅料变更时l当原料产地来源发生变更时l当质量标准中某一项目分析方法发生改变时。