《第九章-结构测定-大分子结构X射线（2）课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第九章-结构测定-大分子结构X射线（2）课件（132页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第九章：结构测定-大分子结构大分子结构解析的难度 首先大分子（生物大分子，主要是蛋白质 ）晶体一定没有中心中心对称，相位不仅 仅是正负号那么简单； 原子数目很多，帕特逊函数确定的原子只 能是很少很少的重原子（假如有的话，很 多情况下还没有重原子）。 实验数据误差很大。解决大分子结构相位问题的主要方 法 同晶差值傅立叶法 分子置换法 同晶置换法 反常衍射法Isomorphous Difference Fourier Analysis：同晶差值傅立叶法 已经知道晶体结构的大部分，需要解析余 下小部分的结构：如测定同晶型单点或多 点突变的蛋白结构（野生型的结构已知） ，确定结合上小分子后的结构。 已
2、知的晶体和待测的晶体必须同晶（空间 群相同，晶胞参数差别小于1%）。 仅仅是小部分的结构有差别，那么已知晶 体的模型可以作为起始相位，通过差值傅 立叶找到其余的部分原子位置。Molecular Replacement：分子置 换法 如果待测的蛋白质存在结构类似的蛋白（ 同源），那么可以用分子置换法解决相位 。 类似的已知结构作为搜索模型（searching model），模型的空间群不必和待解析晶体 一致。同源的两种含义： Homology：两条多肽链相应位点的氨基酸 不同，但是尺寸、疏水性等化学性质类似 ；（positive） Identity：两条多肽链相应位置的氨基酸完 全相同。根据序列
3、查找同源结构 BLAST! http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ 输入序列，BLAST根据序列查找目前的数 据库中已有蛋白与输入序列的同源程度。 同源度越高，成功可能性越大。分子置换法的原理 确定了待测晶体（B）的空间群后，利用同 源的模型（A）设法找到B中分子在晶胞中 的位置（x、y、z）和取向（a、b、g）， 从而得到B的结构模型，初始相位就可获得 。 先旋转，后平移。旋转平移旋转问题：旋转函数 旋转函数定义为： PA为晶体A的Patterson函数，U为晶体A 的Patterson矢量所在的球形区域。C为a 、b、g三个角度所定义的旋转变换矩阵。 PB,R为晶体B的pa
4、tterson函数经C变换后得 到的函数。 如果旋转晶体，其Patterson函数也以同样 的方式选转：即矩阵C作用于Patterson函 数P(u)得到旋转Patterson函数PR(u)。 旋转函数就是PA和PB,R在U空间的相关函数 。 如果晶体A里的分子和晶体B里的分子类似 ，那么旋转到两个分子重叠时，旋转函数 有极大值。Rotation functionabg旋转函数计算旋转函数注意的事项 低分辨的衍射数据通常不用，这部分数据 对旋转不敏感，而且由于溶剂散射的影响 ，其精度可能较差。 高分辨的数据也不能用，这部分数据对旋 转太敏感，误差也大。 合适的分辨率范围是310A。有时需要尝试
5、 不同的分辨率范围。 积分区域：通常选为球形，其半径通常等 于或小于分子的直径。有时也需要尝试。 模型选取：易变性较强的氨基酸残基（通 过同源蛋白氨基酸残基序列比较，可以确 定残基的保守性和易变性）通常不要；溶 剂分子不要；温度因子都选为一个合适的 值；有时需要人工构建一个P1晶胞以消除 分子间原子矢量的影响。平移函数 确定了旋转的角度abg后，把旋转后的模 型分子在（待测）晶胞内作可能的平移， 计算不同平移下F的相关因子（correlation coefficient）： 标准的线性相关因子（standard linear correlation coefficient）C为： 当模型分子与
6、待测分子重合时，相关因子有 极大值。MR的例子 来源于拟南芥（A. thaliana）的乙酰羟酸合 成酶AHAS（EC2.2.2.6，acetohydroxyacid synthase，过去曾被称为ALS，现在则统称 为AHAS）结构。 衍射数据取到3.0A。 模型用来源于酵母的AHAS结构。这是一个 二聚体，从PDB数据里提出一个单体作为 模型，去掉水分子。PDB数据库 Protein Data Bank（PDB）收集了目前解 析出来的蛋白质结构； http:/www.rcsb.org/pdb BLAST找到同源蛋白后，可以到PDB里下 载结构。 同CCP4软件包进行分子置换法。 用CNS也
7、可以。注意： 由于目前解析生物大分子结构的软件有很 多，各个软件的文件格式不同，因此格式 转换很繁琐。例如用HKL2000作数据处理 得到的强度文件需要转换为二进制文件。 CCP4软件包里有很多程序就是转换用的。 解析结构也需要在不同软件之间反复切换 使用。第一步：准备数据 原始数据是用HKL2000（ DENZO/SCALEPACK）得到的SCA文件； 用CCP4转换成MTZ文件。 SCA文件记录的是衍射强度，转换为衍射 振幅记录在MTZ文件中。具体步骤（1） 数据：atahas_94827.sca 注意设置好工作目录：CCP4中的选项 Directories raw Intensities
8、 wavelength 0.9787 ! wavelength value fprimv_mad -5.9 ! f value at this wavelength fprprv_mad 4.1 ! f“ value at this wavelength 四个波长的数据都输入。scriptnres 570 !approx # of residues of protein in asymmetric unit nanomalous 8 !approx # of anomalously scattering atoms in a.u. SCALE_MAD ! read in and localsc
9、ale the data ANALYZE_MAD ! run MADMRG and MADBST and analyze all the Pattersons SOLVE ! Solve the structure Exit 这里告诉solve程序的内容包括晶体的空间群（在 solve.setup中），数据格式（denzo处理的数据 ，已经scale过了），数据文件名，蛋白中的氨基 酸数目，反常散射原子数目等。 然后运行solve。结果：重原子位置-TOP SOLUTION FOUND BY SOLVE ( = 0.56; score = 48.66) -X Y Z OCCUP B HEIGH
10、T/SIGMA1 0.239 0.094 0.150 0.536 19.1 27.61 0.807 0.423 0.156 0.612 25.4 28.31 0.244 0.080 0.098 0.689 32.4 28.11 0.800 0.433 0.102 0.646 30.2 27.91 0.156 0.410 0.243 0.669 36.3 24.41 0.198 0.118 0.251 0.619 36.5 24.41 0.613 0.461 0.185 0.771 43.3 24.91 0.428 0.060 0.182 0.724 35.9 24.5TIME REQUIRED
11、 TO OBTAIN THIS SOLUTION: 33 MIN重原子结构双解 通过Patterson函数得到的重原子（反常散 射原子）结构是双解：真实解和对映体的 解。（如在solve得出的另一个文件 solve_inverse.xyz）。 解决方法是分别给予这两个重原子结构计 算相位，比较电子密度图，符合程度好的 那个即为正确解。CCP4中的程序abs也可 以解决这个问题。相位 相位包含在输出的文件solve.mtz中。其他软件 shelxd，sharp，CCP4，CNS都可以做同 样的工作。 里面涉及的计算方法非常多，很难判断那 个方法更好，往往需要在不同阶段使用不 同软件。 目前最好的
12、应该是OASIS 2004。相位改进：phase improvement 无论是MR，还是MIR/SIR，MAD/SAD ，初始的相位还是很粗糙的。需要做相 位改进。 密度修饰（density modification）是最 有效的方法之一。CCP4的dm程序， resolve，CNS等都可以完成这个工作 。 密度修饰的思路就是：通过相位得到的 电子密度图必须象蛋白，即具有蛋白质 的一些特征。结构解析 要得到质 量良好的 电子密度 图，才可 以确定出 原子的位 置来。 初始的密 度由于相 位误差较 大，确定 原子位置 困难。密度修饰迭代改善相角 溶剂平滑(Solvent flattening)
13、 溶剂翻转(Solvent flipping) 密度分布匹配(Histogram matching) 分子平均(NCS averaging) 骨架识别(Skeletonization) Atomisation Multiresolution modificationSolvent Flattening Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography B. C. Wang, Methods Enzymol. 1985. 生物大分子通常以球状形式存在，当堆积时，会 在分子间形成空隙，这些空隙由溶液占据，溶液 区分子是无
14、序的； 一个好的电子密度图，溶剂区的密度应接近于一 个常数； 相角误差带来的噪音会使溶剂区内的电子密度发 生变化； 用一定的方法可以确定蛋白分子与溶剂分子的边 界，并将溶剂区的电子密度重置为一个较低的平 均值，平均掉噪音，提高了信噪比，从而改善相 角； 程序：DM(CCP4), CNS。Wanging的原理Defining the solvent region 蛋白区的电子密度平均值应高于溶剂区的电子 密度平均值，这部分信息通常来源于低分辨率 数据； 溶剂区的密度起伏应远小于蛋白区的密度起伏 ，这部分信息通常来源于高分辨率数据。 结合低分辨数据估计一个溶剂区的电子密度 rsolv； 找出溶剂区域和蛋白区域，然后把溶剂区的密 度全部设定为rsolv ，蛋白区域不变。这样得到 一个新的密度。 新的密度IFFT，得出新的相位，结合到实验得 到的振幅上，FFT得出下一轮的密度。 迭代Solvent Flipping Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial F1 ATPase, J. P. Abrahams B 1.5:1 1.8x,y,z; B 3.1:1 1.5x,y,z; B 5.4:1 1.5x,y,z; U11U12U1
